ELISA法檢測動物血液、尿液及臟器中藥物殘留量

丁 丹方友平王有祥楊勇敏徐丹華

1.湖北省十堰市動物產品質量監督檢驗測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛生監督所，湖北十堰 442000

ELISA法檢測動物血液、尿液及臟器中藥物殘留量

丁 丹1方友平2王有祥2楊勇敏2徐丹華1

1.湖北省十堰市動物產品質量監督檢驗測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛生監督所，湖北十堰 442000

為了探尋較為方便、有效的藥物殘留測定方法，十堰市動物衛生監督所和十堰市動物產品質量監督檢驗測試中心進行了利用動物血液來檢測克倫特羅含量的技術嘗試，分別采集動物血液、臟器和尿液進行克倫特羅含量檢測，發現不同部位樣品的克倫特羅含量有差異性、相關性和規律性。

ELISA法；血液；尿液；肝臟；藥物殘留

酶聯免疫法（ELISA）基本原理是：把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，結合在固相載體上的酶量與標本中受體物質的量有一定的比例，加入酶反應的底物后，底物被酶催化水解或發生氧化還原反應而成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。ELISA法具有靈敏性高等特點，廣泛應用于動物體內藥物殘留測定。然而，人們往往將動物尿液和臟器作為樣品進行檢測，但臟器只能屠宰后才可進行檢測，尿液采集也因條件限制費工費時。能否利用動物血液來檢測克倫特羅（俗稱“瘦肉精”）含量，十堰市動物衛生監督所和十堰市動物產品質量監督檢驗測試中心對此進行了技術嘗試。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及試劑

Sunrise酶標儀（濾光片波長為450 nm/630 nm）、離心機（3 000～4 000 r/min）、微量移液器（10～300 μL，單道、多道）。酶聯免疫試劑盒Ⅲ、Ⅳ型（由北京維德維康生物技術公司生產）：克倫特羅酶標板、標準品工作液（濃度分別為0.0、0.1、0.3、0.9、 2.7、8.1 μg/L）、高濃度（100 μg/L）標準品、克倫特羅酶標記物濃縮液及稀釋液、洗滌液、底物A液及B液、終止液、組織提取液等。

1.2 試驗動物

隨機挑選8頭健康的育肥豬，平均體重60 kg左右，按常規飼養，自由飲水，飼喂配合日糧（不含抗菌藥物），于飼料中添加5 mg/kg鹽酸克倫特羅，連續飼喂20 d。

1.3 樣品測定

分別于飼喂期第0（6 h）、1、2、3、5、7、10、14、20天采集豬的尿液和血液檢測克倫特羅含量，再于停藥期第0（6 h）、1、2、4、8、10、14、20天采集對應豬的尿液和血液進行檢測。停藥當天，采集血液和尿液后，隨機選擇4頭豬屠宰，采其肝臟，對應編號，測定克倫特羅的含量；停藥第20天，屠宰剩余4頭豬，測定肝臟中克倫特羅的含量。

1）樣品的制備。尿樣和血樣：將飼喂期及停藥期第0（6 h）、1、2天采集的尿液離心、取上清液稀釋100倍待用，血液稀釋10倍待用；再將停藥期第4、8、10、14、20天采集的尿液離心、稀釋10倍待用，血液不稀釋。肝臟樣品：取2 g均質后的樣品，加入6 mL稀釋好的組織提取液，充分渦動2 min，4 200 r/min以上離心10 min，取上清液待檢。

2）溶液的配制。用酶標記物稀釋液按1∶10配制酶標記物工作液，待用；用去離子水按1∶20配制洗滌工作液，取上清液進行檢測。

3）檢測步驟。每孔分別加入標準品、待測樣品（標準品和樣品做兩孔平行試驗）各20 μL；然后加入已稀釋的克倫特羅酶標記物50 μL，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板，充分混合后，室溫（25℃）下避光反應30 min；洗板后，每孔加入100 μL底物（A、B溶液按體積比1∶1混合），室溫下避光反應10～15 min，每孔加入50 μL終止液，于酶標儀450 nm波長（參考波長630 nm）處測定結果。

1.4 添加回收試驗

添加濃度為2 μg/L的克倫特羅標準工作液，8個平行，方法同樣品檢測方法。

1.5 數據分析

各標準品或樣品的平均吸光度值，除以零標（濃度為0 μg/L標準品）的吸光度值，乘以100%，即可得到各標準品對應吸光度的百分比。以吸光度的百分比為縱坐標、標準品濃度的自然對數為橫坐標構建標準曲線。將待檢樣品的吸光度的百分比代入標準曲線，得出樣品對應的濃度，再乘以樣品的稀釋倍數，即為樣品實際殘留量。

用RIDAWIN數據分析軟件對數據進行分析，得出試料中克倫特羅的含量。

2 結果與分析

1）飼喂克倫特羅6 h后，豬尿液和血液中即出現高含量的克倫特羅，8頭豬尿液中的克倫特羅殘留量達到242.0～916.0 μg/L，血液中的殘留量達到6.2～13.8 μg/L，詳見表1。

喂藥期間，豬尿液和血液中的克倫特羅殘留量總體呈上升趨勢，并呈一定的正相關性，y＝86.17x－326.06，r＝0.968 4，在飼喂第10天達到高峰，詳見表2。

2）停藥后0～2 d，豬尿液和血液中克倫特羅殘留量迅速下降，分別由停藥當天的502.50、14.40 μg/L下降到停藥2 d后的73.30、5.43 μg/L，隨后下降緩慢；停藥后第14天克倫特羅殘留量仍高于中國農業部規定的豬尿中最高檢測殘留量1 μg/L的標準，詳見表3。

在整個休藥期間，尿液中克倫特羅含量和血液中克倫特羅含量也呈正相關性，y＝38.869x＋146.73，r＝0.958 7。停藥當天肝組織中克倫特羅含量高達1 823.30 μg/L，說明克倫特羅容易在肝組織中累積；停藥第20天屠宰，肝組織中克倫特羅平均殘留量為6.83 μg/L，仍然超標，易引發中毒事件。

3）每次檢測均設置添加回收試驗，回收率范圍在78.9%～94.2%。被檢樣品送省內大專院校運用GC-MS法進行驗證，與實驗室檢測結果相符。

表1 飼喂6 h后血液和尿液中克倫特羅殘留量 μg/L

表2 飼喂期血液和尿液中克倫特羅平均殘留量 μg/L

表3 休藥期各組織克倫特羅殘留含量 μg/L

3 討 論

通過試驗表明，隨著飼喂時間的延長，克倫特羅在豬體內的含量逐步上升并在豬體內累積，存在相對穩定的趨勢。在停藥后第20天檢測血液，仍能檢測到克倫特羅殘留量，而人們往往忽視了血液中克倫特羅殘留的監控。本試驗表明，運用ELISA技術檢測血液中克倫特羅含量，從而監控生豬是否違禁添加克倫特羅是可行的。對于獸醫部門來說，血液是最容易獲得、也是覆蓋面最全的樣品，因此可通過檢測血液中克倫特羅含量，達到動物活動篩選的目的，從而從源頭上控制動物產品安全。

ELISA法是檢測克倫特羅較高效的免疫分析法，也是國家標準中動物性食品中克倫特羅的篩選方法。從本次試驗可以看出，用ELISA試劑盒檢測克倫特羅，具有較高的靈敏度和特異性，適用于大批量血液樣品中克倫特羅的定性與定量檢測，能較好地滿足基層實驗室對生豬克倫特羅含量的檢測。

目前我國規定組織中的最高殘留限量為不得檢出，但ELISA方法為快速篩選方法，存在假陽性情況，因此農業部規定的陽性判定限為1 μg/L。從本次試驗結果可知，停藥后第20天尿液和肝組織中克倫特羅含量超標，而血液中克倫特羅含量為0.93 μg/L，略低于判定標準。因此，以血液作為檢測對象時，檢測陽性判定限越低越好，可參考歐盟組織的規定（0.5 μg/L）。

家禽免疫方法多 春季飲水最簡便

春季是疫病的高發期，適時進行免疫是有效控制疫病發生的重要手段。家禽免疫方法很多，但其最簡便的方法就是飲水免疫法。

飲水免疫以其方便、省事、省力、應激小等優點，已被大多數養殖戶接受。但很多養殖戶對飲水免疫的操作規程和具體實施細節還認識不透徹，不能夠充分發揮飲水免疫的作用，從而造成免疫失敗。所以要想使飲水免疫收到最理想的效果，必須注意以下9點。

1）使用高效弱毒疫苗。飲水前必須注意疫苗的質量、有效期。不可使用劣質、過期疫苗及貯存不當的疫苗。

2）飲水免疫前，將供水系統、飲水器具徹底清洗干凈，但不能用消毒劑和洗滌劑處理。飲水器具不能用金屬制品，最好用瓷器和塑制器具。

3）飲水免疫用水應是蒸餾水、冷開水或清潔的深井水。水中不應含有重金屬離子和鹵族元素。自來水應煮沸后放置過夜再使用。對大型養雞場，可在自來水中加入去氧劑，每10 L水中加入10%的硫代硫酸鈉3～10 mL，具體用量還要看水中的氯含量而定。

4）疫苗應開瓶倒入水中，用潔凈木棍攪拌均勻。如果室外風大，應在室內進行稀釋。最好在稀釋液中加入0.2%～0.5%的脫脂奶粉或山梨糖醇，以保護疫苗效價。

5）飲水免疫前應停水3～6 h，停水時間長短應視室溫高低和飼料干濕程度靈活掌握。室溫高且喂干粉料時，停水時間短些；室溫低時，停水時間長些。

6）飲水前必須按照雞群數量多少、雞齡大小確定飲水器的數量，使90%以上的雞能同時飲到足夠的疫苗水。雞群大、飲水器不足時可分批進行，防止疫苗失效。

7）稀釋疫苗的水量要適宜，不可過多或過少，應參照疫苗使用說明、免疫雞日齡大小和數量以及當時的室溫來確定。疫苗水應1～2 h內飲完，但為了讓每只雞都能飲到足夠量的疫苗，飲水時間又不應少于1 h。可在用疫苗前3 d連續記錄雞的飲水量，取其平均值以確定飲水量。

8）炎熱季節，飲水免疫宜在清晨進行，應避開高溫時間。疫苗稀釋液不得暴露在陽光下。

9）飲水免疫前后2 d（合計5 d，最好是7～10 d）內飲水、飼料中不得加入能滅殺疫苗中病毒（或細菌）的藥物及消毒劑。

來源：農村報

2014-01-20

楊勇敏

丁 丹，女，1977年生，碩士，獸醫師。