Livin和Smac在鮑恩病及皮膚鱗狀細胞癌中的表達

李春霞 魏紅軍 郜玉玲 史同新 李 民 曲才杰

Livin和Smac在鮑恩病及皮膚鱗狀細胞癌中的表達

李春霞 魏紅軍 郜玉玲 史同新 李 民 曲才杰?

目的: 確定Livin和Smac在鮑恩病(BD)及皮膚鱗狀細胞癌(SCC)中的表達和意義。方法:應用免疫組化SP法檢測35例BD和32例SCC中Livin和Smac的表達,分析二者表達的相關性。結果: Livin表達:BD組高于BD癌旁組織(P＜0.001)；BD癌旁組織高于正常對照組(P＜0.05)。SCC組高于SCC癌旁組織(P＜0.001)；SCC癌旁組織高于正常對照組(P＜0.05)。SCC組高于BD組(P＜0.05)。Smac表達:BD組低于BD癌旁組織(P＜0.01)；BD癌旁組織低于正常對照組(P＜0.05)；SCC組低于SCC癌旁組織(P＜0.001)；SCC癌旁組織低于正常對照組(P＜0.05)；SCC組低于BD組(P＜0.05)。Livin和Smac在BD中表達無相關性(P＞0.05),在SCC中表達呈負相關(P＜0.05)。結論: Livin的過表達和Smac的低表達可能在BD和SCC的發生、發展中起一定作用。

鮑恩病； 癌； 鱗狀細胞； Livin； Smac

鮑恩病(Bowen's disease,BD)和皮膚鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)是常見的皮膚惡性腫瘤,其中BD屬于原位鱗狀細胞癌,少數可發展為侵襲性鱗狀細胞癌。細胞凋亡調控異常在腫瘤形成過程中起十分重要的作用。Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成員,在大多數惡性腫瘤細胞中高表達,抑制細胞的凋亡。Smac為第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑,通過去除IAPs對半胱氨酸蛋白酶的抑制作用,促進細胞的凋亡。本研究利用免疫組織化學技術分析Livin和Smac在BD、皮膚SCC以及癌旁組織中的表達,以探討Livin和Smac在BD和皮膚SCC的發生、發展中所起的作用。

1 對象與方法

1.1 對象和試劑 32例SCC和35例BD標本均來自青島市市立醫院皮膚科2007年1月至2012年6月資料保存完整的病例。其中男37例,女30例,男:女為1.23∶1,年齡41～90歲,平均72.4±13.0歲,病程1個月～10年,平均1.7±1.2年。所有病例均無淋巴結轉移。35例BD中皮損單發33例,其中發生于頭面部6例,軀干12例,四肢13例,手背1例,甲床1例。多發2例,其中1例累及軀干和四肢,1例累及頭皮、軀干和四肢。32例SCC均為單發,其中發生于頭面部8例,軀干8例,四肢7例,口唇3例,女陰3例,陰莖2例,肛周1例。32例SCC按Broder分級標準1均為I級。對照組30例為皮膚外科美容手術中修剪遺棄的正常皮膚。

兔抗人Livin多克隆抗體,工作濃度1∶200,兔抗人Smac多克隆抗體,工作濃度1∶100,均購自北京博奧森生物技術有限公司。通用型免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購于福建邁新生物技術公司。

1.2 方法 Livin和Smac的檢測均采用免疫組化SP法,實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行,用已知染色陽性的組織切片為陽性對照,用PBS代替一抗為陰性對照。

結果判定標準:Livin陽性表達為細胞質和(或)細胞核內出現棕黃色顆粒,Smac陽性表達為細胞質內出現棕黃色顆粒。參考文獻2的半定量計數方法,根據腫瘤細胞的染色率和染色強度進行判定。在400倍鏡下隨機選取10個視野,每個視野計數100個腫瘤細胞,觀察細胞的染色強度,計算陽性細胞百分率。腫瘤細胞陽性率＜5%為0分,5%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,＞75%為4分；根據染色強度分為4級,無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。每個視野陽性細胞百分率與染色強度得分相乘為該視野得分,最終得分為5個視野得分的平均值。0～4分為陰性,5～8分為陽性,9～12分為強陽性。以陽性例數和強陽性例數合并計算陽性率。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行χ2檢驗及Spearman相關分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Livin和Smac的表達 Livin在BD和SCC的表達見表1。Livin在BD中表達強陽性14例(圖1),陽性12例(圖2),陽性率為74.29%；在BD癌旁組織和正常對照組陽性率分別為22.88%和3.33%。Livin在BD中表達率高于BD癌旁組織(χ2＝18.529,P＜0.001)和正常對照組(χ2＝33.488,P＜0.001)；在BD癌旁組織表達率高于正常對照組(χ2＝5.162,P＜0.05)。Livin在SCC中表達強陽性21例(圖3),陽性9例(圖4),陽性率為93.75%；在SCC癌旁組織陽性率為25.00%。Livin在SCC中表達率高于癌旁組織(χ2＝31.352,P＜0.001)和正常對照組(χ2＝50.633,P＜0.001)；在SCC癌旁組織表達率高于正常對照組(χ2＝5.858,P＜0.05)。Livin在SCC中的表達率高于BD (χ2＝4.615,P＜0.05)。

Smac在SCC和BD的表達情況見表1。Smac在BD中表達強陽性8例,陽性10例,陰性17例(圖5),陽性率為51.43%；在BD癌旁組織和正常對照組陽性率分別為82.86%和100.00%。Smac在BD中表達率低于癌旁組織(χ2＝7.835,P＜0.01)和正常對照組(χ2＝19.732,P＜0.001)；在BD癌旁組織表達率低于正常對照組(χ2＝5.666,P＜0.05)。Smac在SCC中表達強陽性1例,陽性7例,陰性24例(圖6),陽性率為25%；在SCC癌旁組織陽性率為84.38%。Smac在SCC中表達率低于癌旁組織(χ2＝22.763,P＜0.001)和正常對照組(χ2＝36.711,P＜0.001)；在SCC癌旁組織表達率低于正常對照組(χ2＝5.099,P＜0.05)。Smac在SCC中的表達率低于BD(χ2＝4.917,P＜0.05)。

2.2 Livin和Smac在BD和SCC中表達的相關性見表2、3。經Spearman相關性分析。Livin和Smac在BD中表達無相關性(r＝－0.210,P＞0.05)；Livin和Smac在SCC中的表達呈負相關(r＝－0.415,P＜0.05)。

表1 Livin和Smac在BD和SCC中的表達

圖1 Livin在BD中強陽性表達(箭頭),細胞質及細胞核呈棕褐色(SP法,×100)圖2 Livin在BD中陽性表達(箭頭),細胞質及細胞核呈淡褐色(SP法,×100)圖3 Livin在SCC中強陽性表達(箭頭),細胞質及細胞核呈棕褐色(SP法,×100)圖4 Livin在SCC中陽性表達(箭頭),細胞質及細胞核呈淡褐色(SP法,×100)圖5 Smac在BD中陰性表達(箭頭),細胞質無著色(SP法,×100)圖6 Smac在SCC中陰性表達(箭頭),細胞質無著色(SP法,×100)

表2 Livin和Smac在BD中表達的相關性

表3 Livin和Smac在SCC中表達的相關性

3 討論

Livin是凋亡抑制蛋白家族的新成員,其N端含有一個高度保守的長約70個氨基酸的桿狀病毒IAPs重復序列(baculovirus IAP repeats,BIR),Livin通過其BIR區與Caspase結合,抑制Caspase的活性,從而抑制細胞的凋亡。Livin在正常人的大多數終末組織中(胎盤除外)低表達或不表達,在大多數惡性腫瘤中高表達。3－5少數研究發現Livin在皮膚SCC中的表達高于正常表皮,認為Livin蛋白的異常表達可能與SCC的發生、發展有關。12,13我們的研究顯示Livin在 SCC中的表達高于正常表皮,文獻報道相似。關于Livin在BD中的表達尚未見報道,本研究顯示Livin在BD中的表達高于正常表皮,但低于SCC,提示Livin蛋白的異常表達可能與BD的發生有關,也可能在BD發展為侵襲性SCC過程中起一定作用。

Smac為第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondria－derived activator of caspase),Smac在正常成人的睪丸表達水平最高,在心臟、肝臟、腎臟等也有較高表達,在腦、肺、胸腺及外周血中為低表達。Smac在正常細胞中不誘發凋亡,在受損細胞中,Smac通過與IAPs的BIR結構域結合,解除IAPs對Caspase的抑制,誘導細胞凋亡。Yoo等6研究了Smac在不同腫瘤中的表達情況,結果顯示:Smac在癌癥中的表達率為62%,其中胃癌42/60,結腸癌7/10,肺癌4/10,卵巢癌7/10,前列腺癌2/10；在肉瘤中表達率為22%,其中惡性神經鞘病2/8,橫紋肌肉瘤5/11,皮膚纖維肉瘤2/7,平滑肌肉瘤1/6,尤文肉瘤1/2,8例血管肉瘤和8例脂肪肉瘤中均無表達。表明Smac在不同腫瘤中的表達不同。一些研究發現Smac在肝癌、胰腺癌、胃癌、口腔鱗癌、皮膚鱗癌組織中的表達低于正常,7－9,11,12在非小細胞肺癌、骨肉瘤組織中的表達高于正常。5,10我們的研究顯示Smac在皮膚SCC中的表達低于正常表皮,提示Smac低表達可能在皮膚SCC的發病中起一定作用。Smac在BD中表達情況目前尚無報道,本研究顯示Smac在BD中的表達低于正常表皮,但高于皮膚SCC,提示Smac蛋白的異常表達可能與BD的發生有關,也可能在BD發展為侵襲性SCC過程中起一定作用。

癌旁組織是指鄰近腫瘤病灶,組織學無惡變特征的組織。本研究顯示Livin在BD和SCC的癌旁組織中的表達低于BD和SCC,但均高于正常對照組,而Smac在BD和SCC的癌旁組織中的表達高于BD和SCC,但均低于正常對照組,提示癌旁組織雖然組織學表現正常,但其凋亡調控已經出現異常,具有惡變傾向。

Livin和Smac在不同腫瘤中表達的相關性報道不一,一些研究顯示Livin和Smac在非小細胞肺癌和骨肉瘤中均為高表達,二者表達呈正相關。5,10另外一些研究顯示Livin蛋白在肝癌、胰腺癌和胃癌組織中表達高于正常,而Smac蛋白在肝癌、胰腺癌和胃癌組織中表達低于正常,二者表達呈負相關,從而認為Livin可能在某些腫瘤的發生、發展中起重要促進作用,而Smac在預防某些腫瘤的的發生、發展中起一定的作用。7－9

本研究顯示Livin在BD和SCC中高表達,Smac在BD和SCC中低表達,二者在BD中表達的相關性無統計學意義,在皮膚SCC中的表達呈負相關,Livin高表達和Smac低表達可能共同參與了BD和皮膚SCC的發生、發展。Livin通過與Caspase結合發揮其抗凋亡作用,Smac通過與Livin結合抑制Livin的抗凋亡作用,發揮其促凋亡作用。Livin的RNG結構具有E3(泛素連接酶)活性,Smac與Livin結合后,Livin通過泛素－蛋白酶體途徑促進Smac降解。總之,抗凋亡蛋白Livin和促凋亡蛋白Smac之間存在著相互拮抗,相互調節的關系。二者表達失調可能共同參與了BD和皮膚SCC的發生、發展。

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6 Yoo NJ,Kim HS,Kim SY,et al.Immunohistochemical analysis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarcomas.APMIS,2003,111(3):382－388.

7李長新,馮震博.Livin、Smac在肝癌中的表達及與凋亡、增殖的關系.臨床肝膽病雜志,2010,26(5):536－539.

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12丁瑜潔,陳曉棟,顧黎雄,等.角化棘皮瘤和皮膚鱗狀細胞癌凋亡相關蛋白表達的研究.中華皮膚科雜志,2012,45(2): 91－94.

13陶菲克,涂亞庭.Livin和Caspase－3在皮膚基底細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌中的表達及相關性分析.中國皮膚性病學雜志,2009,23(2):88－94.

(收稿:2013－09－08 修回:2013－10－15)

The expression and significance of Livin and Smac protein in Bowen's disease and skin squamous cell carcinoma

LIChun-xia,WEIHong-jun,GAO Yu-ling,et al.Department of Dermatology,Qingdao Municipal Hospital, Qingdao,266011

Objective:To investigate the expression and significance of Livin and Smac protein in Bowen's disease(BD)and skin squamous cell carcinoma(SCC).Methods:Immmunohistochemical SP method was used to detect the expression of Livin and Smac in 35 cases of BD and 32 cases of SCC.The relationship between the expressions of BD and Smac was analyzed.Results:The expression of Livin was higher in BD group than in adjacent tissue of BD(P＜0.001)and higher in adjacent tissue of BD than in control group(P＜0.05). The expression of Livin was higher in SCC group than in adjacent tissue of SCC(P＜0.001)and was higher in adjacent tissue of SCC than in control group(P＜0.05).The expression of Livin was higher in SCC group than in BD group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in BD group than in adjacent tissue of BD(P＜0.001)and lower in adjacent tissue of BD than in control group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in SCC group than in adjacent tissue of SCC(P＜0.001)and was lower in adjacent tissue of SCC than in control group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in SCC group than in BD group(P＜0.05).There was no relationship between the expression of Livin and Smac in BD(P＞0.05).There was a negative relationship between the expression of Livin and Smac in SCC(P＜0.05).Conclusion:The over－expression of Livin and low expression of Smacmay be involved in the occurrence and development of BD and SCC.

Bowen's disease；carcinoma；squamous cell；Livin；Smac

青島市市立醫院,山東青島,266011

?通信作者