尋常痤瘡皮損炎癥程度與外周血Th17細胞和IL－17的關系

馬新華 邵文俊 金宛宛 高 宇

·論著·

尋常痤瘡皮損炎癥程度與外周血Th17細胞和IL－17的關系

馬新華 邵文俊 金宛宛 高 宇?

目的: 確定尋常痤瘡皮損炎癥程度與外周血Th17細胞和IL－17的相關性。方法: 采用流式細胞儀檢測外周血Th17細胞水平,酶聯吸附試驗(ELISA)檢測外周血單核細胞IL－17A mRNA的表達,RT－PCR法檢測IL－17A mRNA水平。結果: 正常對照組、輕度痤瘡組3項指標顯著低于中重度痤瘡組(P＜0.05),健康對照組和輕度痤瘡組之間無顯著差別(P＞0.05)。結論: Th17細胞可能和中重度痤瘡的發病和炎癥性皮損的形成有關,有望通過抑制Th17細胞的作用來治療中重度痤瘡。

痤瘡； Th17細胞； 白介素17； IL－17A mRNA

Th17細胞是一類新近發現的CD4＋T細胞,研究發現,Th17細胞在防御細菌感染、介導慢性炎癥以及自身免疫病中發揮重要作用。1尋常痤瘡表現為面部丘疹、膿皰、囊腫性皮疹,特別是中重度痤瘡,臨床炎癥性皮疹更多,嚴重程度更重,Th17細胞在中重度痤瘡的病理機制中可能有比較重要的意義。通過檢測尋常痤瘡患者外周血Th17細胞效應因子、數量以及外周血單個核細胞(PBMC)IL－17A mRNA水平,以確定Th17細胞與尋常痤瘡發病的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 根據Pillsbury法,2將尋常痤瘡患者分為I～IV度,輕度痤瘡(即I度)組,中重度痤瘡(即II～IV度)組。所有病例為我院門診患者隨機選取32例輕度痤瘡患者,35例中重度痤瘡患者,30例健康對照組為正常體檢者,所入選者2個月內未使用糖皮質激素、免疫抑制劑、抗生素。本研究中臨床標本的采集均經溫州醫學院附屬第二醫院倫理委員會批準,并同研究對象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 本研究所用試劑:培養基RPMI 1640由Hyclone公司提供,滅活胎牛血清由晶美生物公司提供,人IL－17 ELISA試劑盒由美國Rapidbio公司提供,淋巴細胞分離液由上海華精生物公司提供,人Th17 Flow試劑盒為美國eBioscience產品,RNA提取試劑由Invitrogen公司提供,M－Mulv Reverse Transcriptase為Promega公司產品,IL－17A mRNA引物設計、合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清樣本以及細胞準備 抽取研究對象的外周血3 mL,室溫靜置30 min,以1500 r/min離心15 min,取其上清液,于－20℃保存備用,剩余樣本加PBS液稀釋1倍混勻后加入分離液Ficoll－Hypaque,以1500 r/min離心10 min,用RPMI 1640培養液重懸細胞,調整細胞濃度為2×106/mL,將PBMC接種于24孔培養板置于5%CO2培養箱37℃培養24 h。

1.3.2 IL－17的檢測 采用人IL－17 ELISA試劑盒,以及多功能微孔板分析儀,檢測各標本IL－17的濃度。

1.3.3 流式細胞術檢測Th17細胞 按照人Th17 Flow試劑盒操作說明書,加入滲透洗脫緩沖液重懸細胞,分別加入FICT標記的人CD4抗體和PE標記的人IL－17A抗體,另設同型陰性對照,作流式細胞術分析,用Thl7細胞占外周血CD4＋T細胞的比例來評價Thl7細胞的水平。

1.3.4 檢測IL－17A mRNA的表達水平 采用RTPCR法,上游引物5'－GAAGGCAGGAATCACA－3',下游引物:5'－TCCGAAATGAGGCTGTCTT－3'。所設計的上游引物處于IL－17A mRNA的108～123 bp位置,下游引物處IL－17AmRNA的594～612 bp位置,此引物擴增片段長度505 bp。β－actin上游引物:5'－CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG－3',下游引物:5'－AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT－3'。將提取的PBMC,調整濃度為2×106/L,Trizol一步法提取總RNA,用紫外分光光度計測定RNA的A260/A280值以確定RNA的純度和總量。取各組5μL總RNA,進行逆轉錄,反應體系為40μL,擴增條件為94℃預變性3 min,94℃30 s,53℃30 s,72℃40 s共28個循環,72℃延伸8min。電泳分析:每個樣品取8μL擴增產物, 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠成像系統攝取各樣品電泳圖,并通過成像分析軟件Quantity One進行半定量分析。

1.4 統計學方法 所有計量數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析,應用單因素方差分析比較中重度痤瘡組、輕度痤瘡組和正常對照組各組間的差異。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組間Th17細胞相關的3項指標比較,見表1。

2.2 Th17細胞占外周血CD4＋細胞比例流式細胞儀檢測,見圖1,PMBC的IL－17A mRNA表達檢測電泳,見圖2。

表1 3組外周血IL－17水平、Th17細胞占外周血CD4＋細胞比例以及PBMC中IL－17A mRNA表達水平

圖1 流式細胞儀檢測不同組別外周血中IL－17細胞所占比例

3 討論

尋常痤瘡皮損是一種原發性炎癥反應,細胞因子在痤瘡皮損形成中目前研究較多是IL－8,作為趨化因子,在炎性痤瘡皮損中表達高于正常皮膚,且與毛囊角化及血管生成成正相關,還與痤瘡進展及嚴重程度有關,阻斷IL－8作用可減少由其產生的炎癥反應及血管生成,有可能控制輕度痤瘡發展為中重度痤瘡。3同樣,細胞因子IL－1活性的增加也可促進細胞角化,而在痤瘡中炎癥反應的形成以及毛囊口的角化過程中發揮作用。4在痤瘡皮損組織修復過程中過度的免疫反應是造成瘢痕的重要因素,所以早期抗炎治療將有助于瘢痕傾向患者避免形成瘢痕。5Th17細胞能產生多種細胞因子,其中研究最多的是IL－17,IL－17家族包括6個成員:IL－17A、B、C、D、E和F,通常認為IL－17A與皮膚炎癥有關聯。有研究者發現,在接種結核分枝桿菌疫苗后,IL－17可促進局部肺組織建立保護性CD4＋T細胞免疫應答。6除了具有促炎癥因子的特性,IL－17還可激活中性粒細胞促其遷移募集到炎癥部位發揮免疫損傷作用。7IL－17也能夠抑制白色念珠菌和曲霉菌感染。8IL－17也能介導炎癥,影響感染、腫瘤和免疫的病理過程。9諸多的研究證明,Th17是慢性炎癥微環境中重要的效應細胞,在病原體等誘導的慢性炎癥過程中發揮重要作用。

尋常痤瘡是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病,Pillsbury分級法將尋常痤瘡進行分級,以表現為黑頭粉刺及散在的炎性丘疹分為輕度,輕度痤瘡病理表現為毛囊漏斗內的角化細胞潴留及毛囊漏斗部囊狀擴張,炎性細胞浸潤較少。而中重度痤瘡表現為炎性的丘疹、膿皰,以及結節和囊腫,其病理表現為毛囊漏斗上皮的破裂,中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、異物巨細胞聚集,明顯的炎癥臨床及病理表現。

圖2 RT－PCR檢測各組外周血單個核細胞IL－17A mRNA表達

我們發現中重度痤瘡患者Th17細胞及其效應因子、IL－17A mRNA表達水平明顯高于正常對照組以及輕度痤瘡患者,差異具有統計學意義,而輕度痤瘡患者與正常對照組之間無顯著差異。這些結果提示:有可能Th17細胞在形成中重度痤瘡炎癥性的皮疹中發揮重要作用,特別是對于炎癥強烈的膿腫、囊腫的形成可能有重要的意義,這也進一步證實了Th17細胞促進炎性反應、募集中性粒細胞的作用。而中重度痤瘡患者外周血中Th17細胞活性增強的機制,目前未明,有待進一步研究。

Th17細胞有可能成為治療中重度痤瘡新的靶點,即通過阻斷Th17細胞的作用,來阻斷尋常痤瘡的炎癥加重,促進炎癥的恢復。

1 Bettelli E,Korn T,Kuchroo VK.Th17:the third member of the effector T cell trilogy.Curr Opin Immunol,2007,19:652－657.

2張學軍.皮膚性病學.8版.北京:人民衛生出版社,2013.175－177.

3Abd EAHS,Shoukry NS,El MRA,et al.Immunohistochemical expression of interleukin 8 in skin biopsies from patientswith inflammatory acne vulgaris.Diagn Pathol,2007,2:4.

4 Jeremy AH,Holland DB,Roberts SG,et al.Inflammatory events are involved in acne lesion initiation.J Invest Dermatol, 2003,121:20－27.

5 Holland DB,Jeremy AH,Roberts SG,et al.Inflammation in acne scarring:a comparison of the responses in lesions from patients prone and notprone to scar.Br JDermatol,2004,150:72－81.

6Khader SA,Cooper AM.IL－23 and IL－17 in tuberculosis.Cytokine,2008,41:79－83.

7 Caruso R,Pallone F,Monteleone G.Emerging role of IL－23/IL－17 axis in H pylori－associated pathology.World J Gastroenterol,2007,13:5547－5551.

8 Zelante T,De Luca A,Bonifazi P,et al.IL－23 and the Th17 pathway promote inflammation and impair antifungal immune resistance.Eur J Immunol,2007,37:2695－2706.

9 Park H,LiZ,Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.Nat Immunol,2005,6:1133－1141.

(收稿:2013－08－22 修回:2013－11－03)

The relationship between the severity of the lesion and Th17 cells and IL－17 level in the peripheral blood of patientswith acne vulgaris

MAXin-hua,SHAOWen-jun,JINWan-wan,et al.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To correlate the severity of the lesion and the level of Th17 cells,and the expression of IL－17 among the patientswith acne vulgaris.Methods:The Th17 cells in the peripheral blood were evaluated by flow cytometry.The IL－17 level in the peripheral blood wasmeasured by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).The level of IL－17A mRNA was detected by RT－PCR.Results:The level of the three parametersmentioned above was lower in healthy controls and the patientswithmild degree of acne vulgaris than in the patientswithmid－and severe acne vulgaris(P＜0.05).Therewas no significant difference in the three parameters between the healthy controls and the patients with mild acne vulgaris(P＞0.05).Conclusion:Th17 cellsmay be involved in the developmentofmid－and severe acne vulgaris and the formation of inflammatory lesions.

acne；Thl7 cells；IL－17；IL－17A mRNA

浙江省溫州市科技局課題(編號:Y20120173)

溫州醫科大學附屬第二醫院皮膚科,溫州,325027

?通信作者