髓核細胞鑒定的研究進展

陽普山，王德利，劉子雙一，吳劍宏，阮狄克

目前髓核細胞尚無特異性細胞標記[1]，通常認為來源于髓核并表達Ⅱ型膠原、SOX-9 和聚集糖胺聚糖的細胞即髓核細胞。僅以Ⅱ型膠原、SOX-9 和聚集糖胺聚糖來在定義髓核細胞顯然是不足的，因為上述細胞標記無法鑒別髓核細胞與軟骨細胞。干細胞治療椎間盤退行性疾病是目前的研究熱點之一[2]，精確鑒定髓核細胞在干細胞治療椎間盤退變的背景下具有重要意義[3]。缺乏對髓核細胞相關特征的認識，阻礙了干細胞治療為代表的髓核再生策略的相關研究。本文將對髓核細胞鑒定相關研究加以綜述，以加深對髓核細胞特異性的認識,為椎間盤退變的相關干細胞治療的研究提供更好的髓核細胞鑒定方法。

1 髓核細胞形態學鑒定

細胞形態學方面：在普通2D培養條件下[4]，原代髓核細胞需6～7 d貼壁, 初貼壁時呈短梭形、多角形, 胞質向外伸突, 然后突起逐漸伸長, 經8～12 d可達亞融合狀態，后呈漩渦狀的細胞團, 胞質豐富, 具有折光性。而纖維環細胞體外普通培養條件下與髓核細胞形態學較為相似，亦為梭形[5]。而軟骨細胞在普通培養條件下為橢圓形細胞[6]。有研究表明髓核細胞形態學可隨著培養條件的變化而發生改變，如髓核細胞在3D培養條件下細胞形態學發生巨大變化，其由梭形細胞變為球形細胞[7]。因此，僅憑細胞形態學對髓核細胞進行鑒別是不可靠的，需結合其他方法才能提高鑒定的可靠性。

2 髓核細胞外基質的鑒定

挪威學者Buckwalter等[8]通過單分子電子顯微鏡技術對狒狒的關節軟骨、髓核細胞的蛋白聚糖結構進行了研究，發現二者細胞外基質蛋白聚糖結構明顯不同:關節軟骨內的蛋白聚糖分子由透明質酸軸絲復合多聚體、非聚合單體形成，而髓核組織內蛋白聚糖則是以非聚合多糖蛋白單體、蛋白多糖簇構成，其內缺乏明顯的透明質酸軸絲。而加拿大學者Mwale等[9]通過定量檢測細胞外基質蛋白聚糖與膠原纖維含量，發現髓核與軟骨細胞基質內蛋白聚糖和膠原的比值明顯不同:髓核細胞其比值為 25∶1，軟骨終板內該值僅為2∶1。因此髓核細胞蛋白聚糖分子結構、蛋白聚糖和膠原的比值與軟骨細胞的差異可作為髓核細胞與軟骨細胞的鑒別點之一。

3 髓核細胞鑒定的相關細胞內因子

椎間盤的髓核細胞內處于一種低氧，高滲透壓，低營養的苛刻生存狀態，為適應這樣苛刻的生存環境，髓核細胞內存在一些特殊的細胞因子，這些特殊的細胞內因子可能作為髓核細胞的鑒定點。Rajpurohit[10]通過Western-blot及免疫組織化學染色發現：小鼠髓核細胞內的細胞低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1， HIF-1α), 葡萄糖轉運蛋白glucose transporter 1，GLUT-1)，間質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)在髓核細胞內較其周圍的纖維環及軟骨細胞有明顯差異表達，提示以上細胞內因子可以作為髓核細胞鑒定的相關分子。Risbud等[11]通過免疫熒光顯微技術及Western-blot技術發現不同氧分壓條件下(21%，2%)鼠、羊及人類髓核細胞恒態高表達HIF-1α。而軟骨細胞內HIF-1α因子在正常氧分壓條件(21%)下無明顯表達，但在低氧分壓條件(2%)下可誘導該分子表達的明顯上調。因此該作者同樣認為HIF-1α用作髓核細胞的相關鑒定。Fujita等[12]則通過基因芯片及PCR技術對比髓核，關節軟骨，肌腱等組織的基因表達情況，發現血管內皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A )在小鼠在髓核細胞明顯高表達，這種差異表達在人類髓核細胞同樣得到驗證。該研究同時發現該因子可能參與髓核細胞在低氧條件下抵抗衰老，維持細胞活性有關，該因子的表達隨退變的發生逐漸下降。因此以上研究認為： HIF-1α，GLUT-1，MMP-2及VEGF-A 有望用于髓核細胞鑒定。

4 髓核細胞表面蛋白分子標記的鑒定

Chen等[13]通過免疫組織化學染色及細胞流式技術發現未成熟的鼠、豬、人髓核細胞表面層連蛋白γ1及其受體(integrinα3，6，β4的亞單位)，CD239，CD151的表達量較纖維環明顯增高。提示以上分子可能作為髓核細胞表面特異性標記之一。Fujita等[14]則通過基因芯片技術比較小鼠髓核組織與其他無血管組織的基因表達譜，從中篩查出5個高表達髓核細胞的膜相關基因即CD24 ，鈉鉀氯共同轉運體,腦葡萄糖轉運蛋白,神經肽Y5受體,磷酯酰肌醇聚糖3(glypican-3,GPC3)。并通過細胞流式技術證實CD24分子特異性高表達于髓核細胞，因此Fujita提出CD24可以作為髓核細胞表面標記蛋白用于鼠髓核細胞的鑒定。該研究團隊后續研究發現血管內皮生長因子受體1(membrane-bound of vascular endothelial growth factor receptor-1，mbVegfr-1)在髓核細胞膜上存在明顯高表達[12]，提示該受體可能作為髓核細胞鑒定的表面蛋白分子。Sakai等[15]對比格犬椎間盤進行了基因表達譜分析，并通過免疫組織化學發現橋粒糖蛋白2(desmoglein2，DSC2)，CD56在髓核細胞表面有特異性高表達，因此提出DSC2，CD56可以作為細胞表面分子用于髓核細胞鑒定。學者Power等[16]則首次應用基因芯片技術對比分析了人類髓核細胞與關節軟骨細胞的基因表達差異，并對其RNA表達差異最大的碳酸酐酶12(carbonic anhydrase-12，CA-12)基因進行免疫組織化學分析，發現CA12蛋白在髓核細胞較纖維環及關節軟骨細胞有明顯特異性表達，提出CA12蛋白可以用作髓核細胞鑒定的表面蛋白分子。綜上研究結果，層連蛋白γ1及其受體(integrinα3，6，β4的亞單位)，CD239，CD151，CD24，mbVegfr-1, DSC2，CD56及CA-12可以作為髓核細胞鑒定的相關表面蛋白分子。

5 髓核細胞內蛋白分子的鑒定

Lee等[17]同樣以小鼠為研究對象進行了類似Fujita的研究。該研究發現GPC3、角蛋白19(Keratin-19 ，K-19)在髓核細胞內表達較纖維環及關節軟骨表達明顯增高。因此認為GPC3及K-19可作為髓核細胞內蛋白分子可用于髓核細胞鑒定。Rutges等[18]則對先前發現的一系列髓核細胞潛在細胞標記在人類髓核細胞是否表達進行驗證，發現僅有K-19在人類年輕的髓核細胞內存在蛋白水平的高表達，但 K-19的表達量隨年齡增長明顯下降，其在54歲以后在人類即無明顯表達，因此該分子無法作為老年髓核細胞的鑒定蛋白分子。

6 髓核細胞“基因標記”的鑒定

自基因芯片出現以來, 基因芯片這種同時具有信息量大、操作簡單、速度快捷等優點的技術就迅速引起人們的注意。一些學者期望通過基因芯片技術篩選出相關髓核細胞高表達基因。

Fujita等[14]通過比較小鼠髓核組織與其他無血管組織的基因表達譜，篩查出五個高表達髓核細胞的膜相關基因：CD24 ，鈉鉀氯共同轉運體,腦葡萄糖轉運蛋白,神經肽Y5受體, GPC3。Lee等[17]于2007年進行了類似Fujita的研究，發現小鼠髓核細胞內膜聯蛋白A3(annexin A3，ANXA3),GPC3, K19，多態性蛋(pleiotrophin，PTN) 等基因在轉錄水平明顯高表達。另外，該研究團隊發現軟骨低聚物蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, CPMP)和基質糖蛋白前體蛋白(matrix gla protein, MGP)基因在髓核細胞較軟骨細胞明顯低表達，提示以上2個基因可能作為髓核鑒定的陰性基因。

小鼠椎間盤內終身存在脊索細胞，這與人類椎間盤內細胞構成不同。因此Sakai等[15]以椎間盤內細胞構成與人類更為近似的比格犬為試驗動物進行了類似Fujita的研究。該研究團隊發現髓核細胞較纖維環及關節軟骨細胞高表達的基因有α-2-巨球蛋白(α-2-Macroglobulin，A2M)、K18、 CD56、DSC2。對比以小鼠為試驗動物的研究結果，早先鼠類髓核發現的一系列標記基因在犬髓核細胞無明顯特異性表達，這強烈提示髓核細胞基因表達譜存在明顯的物種間變異。

Minogue等[19]則應用基因芯片技術對牛的髓核與關節軟骨、纖維環細胞進行了基因表達譜對比分析，發現了一系列髓核相關標記基因，其中突觸相關蛋白25(synaptosomal associated protein-25, SNAP25), K-8, K-19, N-鈣相關蛋白(N-cadherin, CDH2), 整合素結合唾液蛋白(integrin-binding sialoprotein, IBSP), 多功能聚糖(versican, VCAN), 腱調蛋白(tenomodulin, TNMD), 腦可溶性蛋白-1(brain attached signalling protein 1, BASP1),叉頭蛋白F1(forkhead box F1, FOXF1) 及微管蛋白(fibulin 1, FBLN1)等基因在人類髓核細胞較纖維環、軟骨細胞存在明顯表達差異。其中IBSP及FBLN1為髓核陰性表達基因,其余基因為髓核陽性基因。該研究者同樣發現牛的髓核細胞基因表達譜與先前鼠、犬的表達譜存在明顯差異，同樣提示髓核基因表達譜的明顯物種間變異。

為了避免種間差異對研究結果的影響，Minogue團隊[20]再次應用基因芯片對人類椎間盤內髓核、纖維環及軟骨細胞進行了基因表達圖譜分析，以找出人類髓核細胞相關基因標志。該研究發現了多個人類髓核細胞陽性標記基因：配對盒蛋白1(paired box 1， PAX1), FOXF1, β-珠蛋白(hemoglobin beta gene，HBB), CA-12, 卵固蛋白2(ovostatin 2，OVOS2)。同時發現多個軟骨細胞高表達基因(即髓核細胞陰性基因)：生長分化因子10(growth differentiation factor 10，GDF10), 細胞因子類似物1(cytokine-like 1，CYTL1), IBSP, FBLN1。Power等[16]于2011年再次對人類髓核、軟骨及纖維環細胞進行基因表達譜分析，發現C-凝集素2B(human C-type lectindomain family2 memberB，CLEC2B)，CA-12 ，γ-肌糖(gamma-sarcoglycan ,SGCG)，酪氨酸激酶受體3(tyrosine-protein kinase receptor,TYRO3)4個基因在髓核中較纖維環及軟骨細胞均有明顯表達差異，因此可以作為鑒定髓核細胞的標記基因。

以上相關研究中的細胞標記見表1。

7 展 望

盡管既往對髓核細胞鑒定進行了大量實驗研究，但是目前通過單一的方法仍然無法精確的鑒定髓核細胞。如細胞形態學方面，髓核細胞的形態在2D和3D培養條件下發生巨大的變化。而特殊的細胞內因子表達也可能因為培養條件及髓核細胞狀態不同而出現表達差異，可能降低特殊細胞因子作為髓核細胞鑒定分子的可靠性。精確地鑒定髓核細胞需要使用不同的鑒定方法對髓核細胞就行綜合的鑒定。可以通過細胞形態及傳統的髓核細胞基因或蛋白(如SOX9,蛋白聚糖，Ⅱ型膠原)對髓核細胞進行初步的鑒定。但是為精確的鑒定髓核細胞，還需要應用新發現的特殊的細胞因子，髓核細胞特殊的基質結構、蛋白聚糖與膠原的構成比，髓核細胞表面標記及新發現的髓核細胞系列髓核細胞標記基因進行綜合的鑒定。只有這樣才能提高髓核細胞鑒定的精確性。

表1 不同物種中發現的髓核細胞標記Tab.1 Different cell markers of nucleus pulposus cell founded in recent years

另外，不同物種來源的髓核細胞在基因及蛋白水平的特異性表達存在巨大的物種間差異。如在小鼠、犬髓核中發現的一系列髓核標記基因中，僅有K-19在人類髓核細胞仍有特異性表達。因此在進行髓核細胞鑒定時，必須考慮髓核細胞表型物種間差異的影響。如對鼠髓核進行鑒定時，需選擇鼠髓核細胞特異性的基因和蛋白；而以人髓核為研究對象時，則需選取相應的人類髓核細胞特異性基因及蛋白進行鑒定。只有這樣才能排除種屬差異而更精確的鑒定髓核細胞。

總之，準確鑒定髓核細胞對研究椎間盤退變的再生及治療均有重要意義。盡管目前學者通過不同技術發現了一些髓核標記，但要完整的認識髓核細胞表型還需更多的研究。相信隨著科學技術的發展及檢測手段的不斷提高，會發找到更為簡便的髓核細胞鑒定方法。

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