單層組織工程纖維環(huán)取向納米纖維支架的構建和初步驗證

楊成偉，鄧國英，楊 洋，莫秀梅，葉曉健

椎間盤的纖維環(huán)由15～25層同心膠原纖維板層構成，每個板層膠原纖維具有高度的取向性，而且每個板層之間膠原纖維方向相反[1-3]。組成纖維環(huán)細胞外基質的膠原纖維和蛋白聚糖所形成的特殊三維結構對于承擔并分解椎間盤所承擔的巨大軸向壓力具有重要作用[4]。退變、外傷等原因都可以引起的纖維環(huán)的退變、撕裂、破損，均可引起髓核突出導致局部炎癥和神經(jīng)根機械壓迫進而導致肢體疼痛和功能障礙。盡管目前主流的腰椎間盤切除手術可獲得很好的臨床療效[5]，但該手術僅能解除壓迫因素并不能修復纖維環(huán)。如能對破損的纖維環(huán)進行有效的生物學修復不但可提高手術療效，還能延緩椎間盤進一步退變。通過組織工程方法構建功能性纖維環(huán)修復材料為椎間盤疾病的治療提供了新的方向，而構建滿足力學和生物學要求的組織工程支架是制備組織工程纖維環(huán)的關鍵。

組織工程纖維環(huán)支架的構建應當盡量模擬纖維環(huán)的細胞外基質的結構特點，通過選用適當?shù)闹苽浞椒ê驮希瑯嫿婢吡W強度和良好組織相容性的生物材料。本實驗采用靜電紡絲的方法，使用力學性能和組織相容性較好的聚左旋乳酸聚己內酯[poly(lactic acid-co-caprolactone, P(LLA-CL)]模擬單層纖維環(huán)組織的結構特點，構建了取向納米纖維支架，并以無規(guī)納米纖維支架為對照，進行力學和生物學評估，探討其作為組織工程纖維環(huán)支架材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 原料

P(LLA-CL)(聚乳酸∶聚己內酯=75∶25，分子量：3.4×105)購自日本GUNZE公司。六氟異丙醇(HFIP)購自上海達瑞精細化學品有限公司。以上原料使用時均不再需要純化。

1.2 支架制備

將P(LLA-CL)按照質量分數(shù)為9%溶解于HFIP溶劑中，密封后置于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌至成為完全透明的溶液。將配制好的P(LLA-CL)溶液注入注射器中，注射器針頭通過導線與直流電高壓發(fā)生器相連，電壓設定為12 KV。P(LLA-CL)溶液的推進速度由微量注射泵控制，流速為1.5 mL/h。制備無規(guī)則納米纖維支架時，使用固定的平板接地鋁箔收集納米纖維，針頭距鋁箔15 cm。制備取向納米纖維支架時，使用直徑為5 cm的接地金屬滾筒收集納米纖維，針頭距滾筒上表面15 cm，滾筒轉速為8.3 m/s。制備好的電紡納米纖維支架置于真空干燥箱內保存，備用。

1.3 支架的形貌觀測

支架的表面形態(tài)使用掃面電鏡(JSM-5600，日本JEOL公司)進行觀察。將制備的納米纖維支架噴金后，使用掃面電鏡觀察支架表面的納米纖維形態(tài)。使用圖像分析軟件Image J分析纖維的直徑、角度分布以及支架孔徑。隨機選取掃描電鏡圖片上的100根納米纖維，測量其直徑和角度。隨機選取掃描電鏡圖片上的100個孔，測量孔徑。

1.4 支架的拉伸力學測試

將制備好的納米纖維支架裁剪成5 mm×20 mm的長條形，測量支架的厚度。將裁剪好的樣品固定于材料力學測試機上，使用材料力學性能顯微測試系統(tǒng)[6]，根據(jù)Nerurkar等[7]介紹的測試方法進行測試。通過測量結果計算支架的斷裂強度、彈性模量和斷裂伸長率3個力學指標。

1.5 在支架上種植并培養(yǎng)骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)

參考Tan等[8]描述的方法，提取原代SD大鼠MSCs。將2種支架分別裁剪成1.2 cm×1.2 cm大小的方形。裁剪后的支架材料通過紫外線照射2 h進行消毒，并將支架浸沒于70%的酒精溶液4 h中增加支架的親水性。消毒處理后的支架置于24孔板中使用干細胞專用培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)孵育過夜。每個支架表面種植MSCs的數(shù)目為5×104，置于37℃，5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基隔天換液。

1.6 細胞增殖實驗

使用細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8，日本Dojindo研究所)對MSCs在2種支架上的增殖情況進行評估。細胞增殖測試選擇接種細胞的第1天和第7天進行。分別提取24孔板中的細胞培養(yǎng)液，并加入含有10%的CCK-8試劑，避光孵育2 h后，使用Model 550型酶標儀(美國Bio-Rad公司)于450 nm進行度數(shù)。根據(jù)前期繪制的標準曲線推算出每個支架上的細胞量。

1.7 細胞形態(tài)觀察

細胞種植培養(yǎng)后7 d，取出種有細胞的納米纖維支架，使用PBS沖洗3次，使用4%多聚甲醛固定30 min，以Triton X通透5 min后，使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國Invitrogen公司)和鬼筆環(huán)肽(美國Invitrogen公司)分別對細胞核和細胞骨架進行染色。使用共聚焦顯微鏡(TCS SP5，德國Leica公司)對支架表面的細胞形態(tài)進行觀察。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 靜電紡絲納米纖維支架的表面形態(tài)

無規(guī)納米纖維支架和取向納米纖維支架表面形態(tài)、纖維直徑分布和角度分布見圖1。無規(guī)納米纖維支架中的納米纖維無序分布，而取向納米纖維支架的大部分納米纖維分布于0°～30°的角度區(qū)間內。無規(guī)納米纖維支架的納米纖維直徑(996.14 nm±137.76 nm)略大于取向納米纖維支架(963.32 nm±158.13 nm)，但兩者無統(tǒng)計學差別。無規(guī)納米纖維支架的孔徑(72.8 μm2±52.6 μm2)明顯大于取向納米纖維支架(16.7 μm2±11.9 μm2)，兩者有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，這一結果和Koepsell等[9]的研究結果一致。

a: 無規(guī)納米纖維支架的電鏡掃描 b: 無規(guī)納米纖維支架纖維角度分布 c: 取向納米纖維支架的電鏡掃描 d: 取向納米纖維支架纖維角度分布
a: Scanning electron microscopy image of electrospun P(LLA-CL) random nanofibrous scaffold b: Angular distributions of nanofibers in random nanofibrous scaffold c: Scanning electron microscopy image of aligned nanofibrous scaffold d: Angular distributions of nanofibers in aligned nanofibrous scaffold
圖12種支架的表面形態(tài)
Fig.1Surfaces of 2 kinds of nanofibrous scaffolds

2.2 納米纖維支架的拉伸力學結果

納米纖維排列的方向性對支架的力學性能影響很大(見圖2)。取向納米纖維支架的3個主要力學指標(斷裂強度、彈性模量和斷裂伸長率)在平行和垂直于纖維方向的2種情況下差異明顯，表明取向納米纖維支架具有各向異性的力學特點。無規(guī)納米纖維支架的力學特點為各項同性，其斷裂強度和彈性模量分別為(6.30±0.42)Mpa和(110.73±11.11)MPa均低于取向納米纖維支架在平行于纖維方向上所測得的結果；而無規(guī)納米纖維支架的斷裂伸長率(111.23±16.51)%要高于取向納米纖維支架在取向方向上的結果(75.70±5.43)%。與Bosworth等[10]的研究結果相似，取向納米纖維支架在取向方向的斷裂強度(21.90±2.01)MPa和彈性模量(385.85±17.46)MPa大約為無規(guī)納米纖維支架的4倍。可見在平行于納米纖維的方向上，取向納米纖維支架的力學強度得到了明顯的增強。

2.3 細胞增殖情況

CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況的結果(見圖3)顯示，在第1和7天，2種支架表面的MSCs均快速增殖，2種支架上第7天的細胞數(shù)目均較第1天時明顯增加，但是2種支架上的細胞數(shù)目在每個時間點上差異均無統(tǒng)計學意義。

2.4 納米纖維支架表面的細胞形態(tài)

MSCs種植于2種納米纖維支架培養(yǎng)7 d后的共聚焦顯微鏡觀察結果如圖4所示。MSCs在無規(guī)納米纖維支架上無序分布，細胞骨架也呈無序狀態(tài)。而細胞在取向納米纖維支架上的排列卻具有明顯的方向性，所有細胞均平行于納米纖維方向定向排列，細胞伸展并呈紡錘形，細胞內骨架蛋白的排列和細胞排列方向相一致。可見支架中納米纖維的排列方向對支架表面細胞的排列和形態(tài)具有明顯的誘導作用。

3 討 論

3.1 取向納米纖維支架的制備

近10年來，靜電紡絲技術[11]作為一種通過電場力制造納米至微米級極細纖維絲的方法，因其相對簡單的技術流程和相對廣泛的原材料選擇，在組織工程支架構建方面得到了廣泛關注并取得了長足的發(fā)展。靜電紡絲纖維具有極高的表面體積比、可調節(jié)的孔隙率及延展性，且靜電紡絲纖維直徑數(shù)量級和細胞外基質纖維相似，因此靜電紡絲組織工程支架能夠模擬細胞外基質，促進細胞和基質及細胞間的相互作用。經(jīng)典的靜電紡絲技術通過平板來收集納米纖維，所得到的支架中納米纖維絲隨機排列，因而該支架具有各項同性的結構和力學特點。但是纖維環(huán)組織具有復雜的板層結構，每個板層中所含的膠原纖維又具有高度的取向性，因此如模擬纖維環(huán)細胞外基質結構特點，就需要獲得纖維排列方向一致的納米纖維支架，最常用辦法是通過高速滾軸來收集電紡纖維。Koepsell等[9]和Nerurkar等[12]研究了不同速度滾軸收集的納米纖維制備取向納米纖維支架的特點，其使用聚己內酯構建取向納米纖維支架，發(fā)現(xiàn)滾軸轉速越快，所構建支架中的納米纖維取向性越強，平行于纖維方向的力學強度也越高。本研究以P(LLA-CL)為原料，使用高速滾軸(8.3 m/s)制備取向納米纖維支架，獲得的支架取向性較高，有87%的納米纖維的角度分布于0°～30°；使用平板接收納米纖維的無規(guī)納米纖維支架纖維方向在各個角度范圍內均勻分布。本研究中發(fā)現(xiàn)取向納米纖維支架的纖維直徑略小于無規(guī)納米纖維支架，盡管這一結果無統(tǒng)計學意義，但是這一現(xiàn)在也在國外報道中[9]出現(xiàn)過。導致這一結果的原因可能是滾軸在高速旋轉的情況下表面的離心力較大，可能將靜電黏附于滾軸表面的納米纖維拉伸，纖維直徑就會減小。同時本研究還發(fā)現(xiàn)取向納米纖維支架的孔徑較無規(guī)納米纖維支架明顯縮小，這一結果和Koepsell等[9]的研究結果相一致，取向度越高則孔徑越小。由于支架的孔徑對于細胞的黏附和增殖具有重要的作用，大孔徑更有利于細胞獲得更充足的養(yǎng)分，因此取向支架的小孔徑可能是后期進一步研究所面臨的主要困難。

a: 拉伸強度 b: 楊氏模量 c: 斷裂伸長率 ‖: 平行于取向納米纖維的纖維方向 ⊥: 垂直于取向納米纖維的纖維方向
a: Tensile strength b: Young’s modulus c: Elongation at break ‖: Parallel presumed fiber direction ⊥: Perpendicular presumed fiber direction
圖22種支架的力學性能
Fig.2Mechanical properties of 2 kinds of nanofibrous scaffolds

圖32種支架的細胞增殖情況
Fig.3Cell proliferation on 2 kinds of nanofibrous scaffolds

a: 無規(guī)納米纖維支架 b: 取向納米纖維支架 藍色:細胞核 紅色:細胞骨架蛋白
a: Random nanofibrous scaffold b: Aligned nanofibous scaffold Blue: Nuclei Red: Cytoskeletal protein
圖42種支架表面MSCs的生長情況(共焦顯微鏡，×400)
Fig.4MSCs on 2 kinds of nanofibrous scaffolds(confocal microscopy，×400)

3.2 取向納米纖維支架的力學分析

無規(guī)納米纖維支架在力學上表現(xiàn)為各項同性，各個方向上的力學指標差異無統(tǒng)計學意義。單層纖維環(huán)具有明顯的各向異性力學特點，拉伸力學測試結果提示，取向納米纖維支架正好能模擬這一特點。對于纖維環(huán)組織工程而言，較強的強度和剛度是對支架材料極為重要的要求。研究已經(jīng)證實，單層人體纖維環(huán)在纖維方向上的拉伸彈性模量為80～120 MPa[3]。國外的研究者[9, 12-13]多使用聚己內酯進行支架構建，聚己內酯雖然具有良好的組織相融性和延展性，但其強度和剛度較差，國外研究者構建的聚己內酯納米纖維支架彈性模量為50 MPa，尚不能達到纖維環(huán)的力學要求。本研究使用P(LLA-CL)作為原料構建納米纖維支架，該材料的強度和剛度都比聚己內酯強很多，拉伸力學結果提示P(LLA-CL)構建的取向納米纖維支架平行于纖維方向的彈性模量為240 MPa，完全滿足纖維環(huán)組織工程的力學要求。

3.3 取向納米纖維支架對細胞形態(tài)的影響

人體纖維環(huán)組織中膠原蛋白均呈束狀分布并具有高度的取向性，同時纖維環(huán)細胞也是沿著膠原束的方向拉伸并定向分布。本研究所制備的取向納米纖維支架具有高度的取向性，細胞能夠在取向納米纖維的影響下沿著納米纖維的方向拉伸并按照纖維方向進行排列。納米纖維對于細胞形態(tài)和細胞骨架的作用已經(jīng)在許多研究中[10, 14]得到了證實。納米纖維通過控制細胞黏附點面積，調節(jié)細胞黏附斑構型從而對張力絲的結構進行調節(jié)。與Li等[15]的研究結果相似，本實驗共聚焦顯微鏡可觀察到MSCs在取向納米纖維支架上取向排列且明顯伸長，細胞骨架也具有明顯的取向性，和無規(guī)納米纖維支架上MSCs的形態(tài)具有明顯的差異。細胞形態(tài)改變和對細胞外基質的分泌具有重要的影響，在取向納米纖維支架上，細胞分泌的細胞外基質同樣具有取向性，而無規(guī)納米纖維支架上的細胞分泌的細胞外基質則是無序的。本研究中取向納米纖維支架對細胞形態(tài)和分布的序列化作用進一步提示其作為纖維環(huán)組織工程支架的可能性。

綜上所述，使用靜電紡絲技術構建的P(LLA-CL)取向納米纖維支架能夠模擬單層纖維環(huán)細胞外基質的結構特點，滿足纖維環(huán)組織工程對支架的力學要求，促進細胞定向拉伸排列，可用于進一步的纖維環(huán)組織工程研究。

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