HPLC法測定藏藥十八味杜鵑丸中黃酮類成分的含量

1.西北民族大學化工學院,甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730070

Abstract:ObjectiveTo establish a HPLC method for the Determination of Flavonoids in Tibetan medicine Shibawei Dujuan pills.MethodsThe HPLC analysis was carried out on Kromasil C18(250mm × 4.6mm，5μm)with a mixture of methanol -0.1% phosphate (50∶50)as the mobile phase. The determination wavelength was set at 360nm with the flow rate of 1.0mL·min-1.ResultsThe hyperosid,quercetin, kaempferol and isorhamntin showed good linearity in the range of 0.0773～0.773μg、0.0467～0.467μg、0.0428～0.428μg and 0.0536～0.536μg respectively.The average recovery rate of hyperosid, quercetin and isorhamntin were 98.76%(RSD=1.71%)、97.57%(RSD=1.16) and 97.74%(RSD=1.26)respectively.ConclusionsThe method is stable and accurate.It can be used for the content determination of flavonoids in tibetan medicine shibawei dujuan pills.

Keywords:Shibawei Dujuan Pills;Flos Rhododendri Anthopgonoidi;HPLC

藏藥十八味杜鵑丸由烈香杜鵑、草果、紅花等十八味藥制成，具有疏風通絡，活血的功效，用于治療“血脈病”引起的四肢麻木，肌肉萎縮，筋腱拘攣，口眼歪斜等癥。原標準收載于《衛生部藥品標準藏藥第一冊》，標準簡單，沒有含量測定項。烈香杜鵑為方中君藥，為杜鵑花科植物烈香杜鵑(RhododendronanthopogonoidesMaxim.)毛喉杜鵑(RhododendroncephalanthumFranch.)及報春花狀杜鵑(RhododendronprimulaeflarumBur.EtFranch.)的干燥花和葉，歷史上藏醫也有以帶葉嫩枝作為藥用部位[1]。烈香杜鵑中含有豐富的黃酮類化合物，其中槲皮素、異鼠李素、金絲桃苷、山奈酚等均具有很好的抗氧化活性，在治療心血管系統疾病方面有廣泛應用[2]，這與十八味杜鵑丸的功能主治相一致。本文采用高效液相色譜法建立了同一色譜條件下同時測定十八味杜鵑丸中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚及異鼠李素含量的方法，并比較了不同廠家不同批號幾種成份的差異，為進一步控制該制劑質量提供可靠的科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；梅特勒XS205DU電子天平(瑞士Mettler toledo公司)；B3200S-T型超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)；MILLI Q超純水系統(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 金絲桃苷對照品(批號：111521-200303)、槲皮素(批號100081-200406)、山柰酚(批號：110861-2004050)、異鼠李素(批號110860-200407)由中國藥品生物制品檢定院提供。十八味杜鵑丸( 批號：090502、111109、110907，寧夏多維藥業有限公司；批號：08097A、10231A、09305A，西藏自治區藏藥廠)。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(4.0mm×250mm，5.0μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(50∶50)；流速：1.0ml/min；檢測波長：360nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品適量，分別加甲醇制成每1ml中含77.26μg、46.7μg、42.8μg、53.6μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品細粉約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 依《衛生部藥品標準藏藥第一冊》十八味杜鵑丸項下方法，取1 /10 處方量，按制備工藝配制不含烈香杜鵑的陰性供試品，再按照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液，即得。

2.5 方法學研究

2.5.1 系統適用性實驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10μl，按照“2.1”項下色譜條件測定，結果表明陰性對照溶液在各對照品色譜峰相應的位置處無雜質峰干擾。供試品色譜圖中金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素與其他組分分離度均大于1.5，分離良好，理論塔板數按槲皮素峰計為8620，符合2010年版《中國藥典》一部附錄的有關要求。

2.5.2 線性關系 取金絲桃苷對照品溶液(77.26μg/ml)、槲皮素對照品溶液(濃度46.7μg/ml)、山柰酚對照品溶液(濃度42.8μg/ml)、異鼠李素對照品溶液(濃度53.6μg/ml)，分別精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，計算回歸方程，結果見表1。

表1 工作曲線考察結果

2.5.3 精密度試驗 分別精密吸取金絲桃苷對照品溶液、槲皮素對照品溶液、山柰酚對照品溶液、異鼠李素對照品溶液各5.0μl，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定金絲桃苷，槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積，峰面積的RSD分別為0.52%、0.95%、1.26%、1.18%。表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗 取供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24h進樣，測定金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積，結果各成分峰面積的RSD分別為1.47%、1.51%、1.42%和1.73%，表明供試品溶液在24小時內穩定。

2.5.5 重復性試驗 取同一批樣品(批號：090502，寧夏多維藥業有限公司)6份，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備溶液，按“2.1”項下色譜條件，進樣測定，計算平均含量，結果金絲桃苷為0.23mg/g，RSD為2.10%；槲皮素為0.18mg/g，RSD為1.45%；山柰酚為0.01mg/g，RSD為1.70%；異鼠李素為0.10mg/g，RSD為1.81%。表明方法重現性好，符合定量標準要求。

2.5.6 加樣回收率試驗 取同一批樣品(批號：090502，寧夏多維藥業有限公司)6份，分別加入金絲桃苷、槲皮素及異鼠李素各適量，按“2.3”項下供試品溶液制備方法處理并測定，計算各成分平均回收率，結果見表2，表明本方法準確可靠。

2.5.7 樣品測定 按“2.3”項下方法，對2個廠家6批樣品依法制備供試品溶液，進樣測定，計算各成分含量，結果見表3。

表2 加樣回收率測定結果

表3 樣品含量測定結果(n=2)

3 討論

含量測定結果表明，寧夏多維藥業有限公司和西藏自治區藏藥廠六批樣品中金絲桃苷、槲皮素的含量較高，山柰酚的含量較低，但六批樣品之間差別不明顯。而異鼠李素的含量兩家藥廠差別較大，其原因可能是烈香杜鵑的用藥部位習慣不同造成。部頒藏藥標準中規定，烈香杜鵑用藥部位為花和葉，但藏區有以帶葉嫩枝入藥的習慣，據文獻[3]報導，烈香杜鵑的花葉中不含異鼠李素。由此可見，分析十八味杜鵑丸中黃酮類成分的含量對控制藥品內在質量很有必要。

樣品中山柰酚的含量較低，經計算在方法學線性范圍之外，所以未做山柰酚的回收率測定，山奈素可作為定性檢測指標，含量數據僅供參考。

[1]羅達尚.中國藏藥(第一卷)[M].上海：上海科技出版社，1996：237.

[2]張娟紅，王榮，賈正平，等．藏藥烈香杜鵑研究概況[J].中國中醫藥信息雜志，2012，19(8)： 104.

[3]牛迎鳳，邵赟，梅麗娟，等．液相測定烈香杜鵑葉總黃酮的含量[J].安徽農業科學，2009，37(24)：11339.