牛腸道病毒2型VP1+表達和間接ELISA方法的建立與應用

郭金玉，高志強，張鶴曉，張樂萃，吳 丹

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽100026）

牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）是小RNA病毒科、腸道病毒屬成員[1]。BEV呈L434結構，球形，無囊膜，大小約為25～30 nm，單股正鏈RNA病毒。BEV分為2型：BEV-1和BEV-2。據(jù)資料報道，在世界其他各國，牛腸道病毒病經(jīng)常在牛群及其周圍環(huán)境中流行[2]。在中國，有關此病流行的報道很少。2005年初北京某牛場發(fā)生牛腸道病毒感染，引起奶牛嚴重腹瀉，降低了其生產(chǎn)性能，吳丹等從中分離得到1株牛腸道病毒毒株[3]，對其進行全基因測序后，確定為BEV-2。2008年，李英利從犢牛糞便中分離出了1株腸道病毒[4]，但不確定其基因型。

BEV一般呈隱性感染，通常只引起輕微的下痢和呼吸道癥狀，但在某些惡劣環(huán)境下，動物突發(fā)應激導致抵抗力下降時，可引起奶牛發(fā)生嚴重的腹瀉，使產(chǎn)奶量大大下降，給畜牧業(yè)帶來極大的損失。因此，對BEV-2預防和診斷技術的研究日益受到人們的重視。為了建立檢測BEV-2抗體的間接ELISA方法，本研究利用原核高效表達系統(tǒng)在大腸桿菌中表達BEV-2型VP1+蛋白，通過對臨床樣品進行檢測，表明該方法具有良好的特異性及重復性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIZol，購自Invitrogen公司；DNA片段回收試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ、質粒快速提取純化試劑盒，購自TaKaRa公司；M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶，購自Promega公司；HRP標記的rec Protein G，購自北京博奧星生物技術有限責任公司。

1.2 病毒、質粒、宿主菌及陽性血清 BEV-2病毒（毒株BJ001），北京檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心提供；原核表達質粒pET-32a，本實驗室保存；大腸桿菌（E.coli）Top10、Rosetta，購自北京康為世紀生物科技有限公司；BEV-2陽性血清，用BEV-2病毒免疫陰性牛制備。

1.3 牛腸道病毒2型VP1+基因擴增、克隆 用DNAMAN軟件將毒株BJ001的全基因序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中提交的BEV序列進行比對和分析，然后用Primer Premier 5.0設計引物，擴增包含VP1（840 bp）蛋白基因片段的VP1+（1 275 bp）序列。引物名稱、序列見表1。

表1 BEV-2的引物名稱和序列

提取BEV-2病毒核酸，以BEV2-VP1-f、BEV2-VP1-r為引物，進行RT-PCR擴增，擴增條件如下：94℃變性2min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)是94℃45 s、51℃45 s、72℃1min，40個循環(huán)后，72℃延伸10 min。將擴增的基因片段克隆至pMD-T19載體并轉化至大腸桿菌Top10中，篩選陽性克隆子，測序正確后，放置-80℃保存。其質粒命名為pMD-T19-BEV2-VP1+。

1.4 原核表達載體的構建及鑒定 將質粒pMDT19-BEV2-VP1+和原核表達質粒pET-32a同時經(jīng)限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，用連接酶連接過夜，次日轉化至大腸桿菌Top10。挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng)后，對菌液進行PCR鑒定，鑒定正確的送公司測序。將重組質粒命名為pET-32a-BEV2-VP1+。

1.5 重組蛋白的誘導表達及優(yōu)化 將重組質粒pET-32a-BEV2-VP1+轉化到Rosetta宿主菌，培養(yǎng)一定時間后，加入IPTG誘導表達，取誘導前后的菌液，12 000 r/min離心10min，收集菌體，充分裂解后，加入等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。取10μL進行SDS-PAGE電泳，電泳顯示該蛋白為包涵體表達。

對培養(yǎng)溫度、誘導時間以及加入IPTG的終濃度等一系列條件進行優(yōu)化。

1.6 包涵體蛋白的洗滌、溶解 將包涵體用含2mol/L、4mol/L、6mol/L尿素的Tris緩沖液依次進行洗滌后，再用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液溶解，最后進行SDS-PAGE檢測。

1.7 蛋白的純化、復性 蛋白純化用HIS.BIND resin蛋白純化試劑盒在變性條件下進行。

將純化后的蛋白裝入透析袋中，透析梯度依次為6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L尿素的Tris緩沖液，進行透析復性。蛋白復性后，用Westernblot檢測其反應原性。

1.8 間接ELISA方法的建立

1.8.1 間接ELISA反應條件的確定 （1）抗原、血清工作濃度的確定：用碳酸鹽緩沖液將抗原按1∶50、1∶100依次倍比稀釋至1∶6 400包被酶標板；用含1%BSA的PBST將陽性血清、陰性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋，進行ELISA方陣試驗，測其OD450nm值，來確定抗原包被濃度和血清最佳工作濃度；（2）酶標蛋白G工作濃度的測定：確定抗原和血清最佳工作濃度后，將酶標蛋白G作1∶500、1∶1 000、1∶1 500稀釋，進行間接ELISA，測其OD450nm值。

1.8.2 封閉液的確定 分別以5%脫脂奶粉、1%牛血清白蛋白和1%卵清蛋白封閉，比較封閉效果。

1.8.3 臨界值的確定 按優(yōu)化好的條件對30份BEV-2陰性血清樣品進行間接ELISA測定，用酶標儀檢測OD450nm值，以OD平均值（-x）加3個標準差（SD）作為判定的臨界值[5]，待檢血清高于此值的判為陽性。

1.8.4 間接ELISA的特異性 用間接ELISA方法檢測IBR陽性血清、BVDV陽性血清、BLV陽性血清、BEV-2陽性血清，驗證該ELISA方法的特異性。

1.8.5 間接ELISA的重復性 用重組蛋白包被ELISA板，選取4份血清樣品，重復4孔，進行板內重復性試驗；用重組蛋白分別包被3塊ELISA板，檢測板間重復性，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析后，分別計算板內和板間變異系數(shù)。

1.9 臨床樣品檢測 用建立的間接ELISA方法檢測美國、澳大利、新西蘭、加拿大進口牛的血清及國內牛血清，統(tǒng)計陽性率。

1.10 間接ELISA與中和試驗結果分析比較 用建立的間接ELISA方法對45份不同中和效價的BEV-2陽性血清做倍比稀釋，測其ELISA效價，與中和效價進行分析比較。

1.11 ELISA包被板保存期的確定 將包被的蛋白酶標板（蛋白包被時加入0.01%疊氮鈉）密封后置于4℃冰箱中保存1個月、3個月、6個月、9個月、12個月進行間接ELISA檢測，測定其穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 牛腸道病毒2型VP1+蛋白擴增結果 對牛腸道病毒2型VP1+蛋白基因進行RT-PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見1條與預期大小（1 275 bp）相符的DNA片段，見圖1。

圖1 RT-PCR擴增結果

2.2 原核表達載體的構建與序列分析 將克隆到pMD-T19載體的目的片段和原核表達質粒pET-32a同時經(jīng)限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，用連接酶連接過夜，成功構建了原核表達載體pET-32a-BEV2-VP1+。將重組質粒進行測序，測序結果與原序列一致。

2.3 重組蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-32a-BEV2-VP1+轉化至Rosetta宿主菌后，在37℃溫箱培養(yǎng)1段時間后，加入IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE顯示在預期分子量大小處即52kDa出現(xiàn)大量表達的特異蛋白條帶（圖2）。

圖2 SDS-PAGE電泳結果

2.4 重組蛋白的表達條件優(yōu)化 經(jīng)摸索確定最佳表達條件為菌液培養(yǎng)至OD600nm數(shù)值到達0.6時，用0.6mmol/L IPTG在37℃誘導4 h，目的蛋白為包涵體表達，最終溶于8mol/L尿素中。

2.5 重組蛋白的純化與復性 純化后得到高純度的重組蛋白（圖3）。Western-blot結果表明重組蛋白具有良好的反應原性。

圖3 純化后的重組蛋白

2.6 間接ELISA方法的建立

2.6.1 間接ELISA反應條件確定 經(jīng)測定，抗原包被濃度為1.56μg/mL，37℃溫箱作用1 h后4℃放置過夜；血清最佳工作濃度為1∶40；酶標蛋白G 1：1 000稀釋時，P/N值相對較大。

2.6.2 封閉液的確定 封閉液用含1%牛血清白蛋白的PBST封閉，37℃作用2 h效果最好。

2.6.3 臨界值的確定 測定30份BEV-2陰性血清，其OD450nm值的-x為0.1762，SD值為0.07211，臨界值為-x+3SD=0.3925。

2.6.4 間接ELISA的特異性 間接ELISA結果顯示，BEV-2陽性血清為陽性。IBR陽性血清、BVDV陽性血清、BLV陽性血清OD450nm值均小于0.3925，為陰性。

2.6.5 間接ELISA的重復性 經(jīng)測定計算，板內變異系數(shù)為2.20%～7.56%，板間變異系數(shù)為2.28%～8.42%，均小于10%，證明該方法準確、可靠、重復性高。

2.7 臨床樣品檢測 用建立的間接ELISA方法檢測362份不同國家牛血清，數(shù)據(jù)顯示：除加拿大以外其他各國陽性率均高達80%以上（表2）。

表2 對不同國家牛血清的檢測

2.8 間接ELISA與中和試驗（NT）結果分析比較

兩種方法同時檢測45份牛血清，陽性符合率為50%，陰性符合率為55.2%，總符合率為53.3%。結果顯示，血清的中和效價和ELISA效價不成正相關（表3）。

表3 NT和間接ELISA的符合率試驗結果

2.9 ELISA包被板保存期的確定 試驗結果顯示，蛋白包被時加入疊氮鈉對試驗結果沒有影響，保存于4℃1～6個月的ELISA包被板陰陽性血清的變異系數(shù)均小于10%，ELISA包被板保存期為6個月。

3 結論與討論

目前，國內外對BEV-2的研究較少，本研究根據(jù)BEV-2病毒（毒株BJ001）設計引物，摸索并優(yōu)化出VP1+蛋白序列的誘導表達條件，表達的重組蛋白溶于8mol/L尿素中，且保持較好的反應原性。用重組蛋白BEV-2 VP1+作為包被抗原，并用HRP標記的rec Protein G為二抗，在國內率先建立了BEV-2的間接ELISA檢測方法。

牛腸道病毒通常是輕度或不顯性感染，在發(fā)生應激、體質虛弱等情況下可引發(fā)顯著癥狀，導致牛發(fā)生多種綜合征，這不僅嚴重降低了奶牛的生產(chǎn)性能，而且還有污染奶制品的可能。跟蹤調查顯示，目前該病兩年就發(fā)生1次，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是：當動物處于惡劣環(huán)境下，其抵抗力會下降，導致機體發(fā)病；發(fā)病后體內抗體升高，維持一段時間后抗體開始下降，從而導致再次發(fā)病。本試驗通過對不同國家進口牛血清的檢測（進口牛血清來自不同國家的不同牛場），可以看出美國、澳大利亞、新西蘭和國內牛血清陽性率非常高，均在80%以上。之所以會出現(xiàn)BEV-2在美國、澳大利亞、新西蘭和我國牛高陽性率的原因可能有兩點：一是BEV-2在環(huán)境中非常穩(wěn)定，能在環(huán)境中存在很長時間，感染后多數(shù)為亞臨床表現(xiàn)，不易被發(fā)現(xiàn)；二是跟放牧形式有關，以上4個國家多采用密集型放牧形式，牛群之間密切接觸，一旦有牛感染，BEV-2就會在牛群中廣泛存在。加拿大牛的血清相對來說陽性率比較低，只有35%，可能與加拿大飼養(yǎng)方式和牛群間相距較遠有關。據(jù)報道，在廣延性的放牧地區(qū)，感染牛腸道病毒的機率較低。加拿大采取了低密度飼養(yǎng)動物的措施，大大降低了牛腸道病毒在環(huán)境中暴發(fā)的危險系數(shù)。

將中和試驗和間接ELISA試驗結果進行比較，可以看出二者的抗體效價不呈現(xiàn)正相關，原因可能是BEV-2的中和位點并非全部落在擴增的目的蛋白序列VP1+上。

本試驗建立的檢測牛腸道病毒2型抗體的間接ELISA方法操作簡單、快捷、具有較高實用價值，該診斷方法將有望更廣泛地應用于臨床病例的診斷和血清學普查。下一步，擬用表達的重組蛋白制備單克隆抗體。

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