豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制I型干擾素機制的研究進展

張 輝，崔煥忠，楊 歡，高云航，楊 倩，常曉博，尹 健，齊 磊，秦貴信

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是世界范圍內給養豬業造成巨大經濟損失的重要疫病之一，病死率高達20%-60%，于1996年在我國首次報道發生。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratory syndromevirus，PRRSV）感染豬后可引起持續性感染，其原因可能為中和抗體產生較慢以及先天免疫反應抑制的結果[1]。研究表明，在感染細胞和豬體內PRRSV可以抑制I型IFN產生，本文對PRRSV抑制I型IFN機制進行了簡要闡述。

1 PRRSV對TLRs的表達及其信號通路的調控

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）在激活先天性免疫中發揮著重要作用，與控制病毒感染相關的有 TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。以 poly（I:C）和PRRSV作用豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolarmac?rophages，PAMs）和豬骨髓造血干細胞來源的幼稚樹突狀細胞，未刺激的PAMs中TLR3、TLR7和TLR8的表達高于幼稚樹突狀細胞；與之相反，PRRSV感染幼稚樹突狀細胞6 h后負調控TLR3、TLR7和TLR8表達，然而在感染后24 h，表達量又恢復到基本水平；poly（I:C）刺激PAMs促進TLR3表達，抑制TLR7和TLR8表達。TLR3的激活導致抗PRRSV反應增強，病毒增殖減少。截短了TLR3的TIR區域可促進PRRSV在Marc-145中增殖，而未截短的TLR3則抑制PRRSV增殖，表明TLR3負調控病毒的增殖，對宿主抗PRRSV的先天性免疫起著重要作用[2]。poly（I:C）與LPS刺激PRRSV感染細胞，TLR4的表達均無變化，但TLR3的表達顯著降低。TLR3識別病毒dsRNA，間接激活IFN調控因子（IFN regulatory factor，IRF）3和IRF7，誘導IFN-α產生，PRRSV通過調控TLR3信號通路來調控IFN產生。

2 PRRSV通過IRF介導的RIG-I/MDA5通路靶向作用于IFN增強子

PRRSV感染Marc-145細胞對IFN-α和IFN-β的轉錄沒有影響，以tRNA處理后，IFN基因與增強子基因的mRNA表達均升高；然而PRRSV感染與tRNA 共同處理，IFN-α、IFN-β、ATF-2和IRF3顯著減少，這是由于PRRSV介導的抑制RIG-I信號通路。PRRSV激活NF-κB和AP-1通路，抑制IRF3 通路[3]。

PRRSV非結構蛋白在抑制I型IFN方面發揮了重要作用。Nsp1α羧基末端14個氨基酸對于下調IFN-β和NF-κB表達水平至關重要，Nsp1β可抑制IRF3的磷酸化與核易位，從而抑制I型IFN產生。Nsp1可強烈抑制IFN-B啟動子激活，并通過核內降解cAMP反應元件結合蛋白（CREB）的結合蛋白（CBP），從而破壞IFN基因表達關鍵增強子的形成。Nsp2含有與OUT結構域相關的早期解離活性位點和CP活性位點，早期解離活性在ISGs和NF–κB信號轉導中發揮作用，CP活性位點抑制IRF3磷酸化與核轉運，負調控I型IFN產生[4]。Nsp4可抑制IFN-β產生。Nsp11可阻斷IRF3和IκB磷酸化，導致IRF3和IκB的核轉運受到抑制，從而抑制RIG-I信號轉導。此外，Nsp11通過NendoU結構域降解IFN-β啟動刺激因子（IPS-1）的mRNA，IPS-1的降解導致下游信號通路的抑制，從而阻礙IRF3和NF-κB下游的激活。

3 PRRSV對NF-κB信號通路的調控

3.1 N蛋白正調控NF-κB通路 病毒根據自身需要來激活或抑制NF-κB通路，因而許多病毒已經進化以阻斷NF-κB激活來逃避宿主先天性免疫。用傳染性胃腸炎病毒刺激豬漿細胞樣DC（plasmacytoid dendritic cells，pDCs），PRRSV 促 進NF-κB磷酸化；而且PRRSV感染Marc-145細胞和PAMs晚期激活了NF-κB通路。病毒激活NF-κB通路，調控宿主細胞的增殖和凋亡，以利于病毒增殖；然而通過超量表達IκBα顯性失活形式來阻止NF-κB的激活并未影響病毒增殖，表明PRRSV激活NF-κB通路可能參與細胞凋亡或調控細胞因子等其他過程[5]。

N蛋白的30-73位氨基酸區域參與NF-κB激活，核定位信號與核仁定位信號都位于這個活性區域，因而推測NF-κB的激活與N蛋白的核定位有關，這個區域對于N端二聚化非常重要，二聚化蛋白可以嵌入到NF-κB激活區域，暗示二聚化可能與NF-κB激活有關[3]。

3.2 Nsp1α 和Nsp2負調控NF-κB通路 Nsp1α可抑制NF-κB激活，利用NF-κB和PRDII熒光素酶報告系統，檢測Nsp1α在轉染24 h后兩種熒光素活性的降低情況。當有Nsp1α存在時，IκBα磷酸化受到抑制，導致刺激TNF-α的NF-κB核轉位阻斷，基因突變表明Nsp1αN端鋅指結構基序（ZF1）對于Nsp1α抑制IFN產生至關重要。目前還不能確定Nsp1降解CBP是由Nsp1α還是Nsp1β介導的，推測細胞質中的Nsp1激活NF-κB，細胞核中的Nsp1通過鋅指結構基序降解CBP[6]。研究發現Nsp1α羧基端的第176位氨基酸能夠抑制IFN-β產生。

泛素化參與RIG-I和TLRs信號轉導，如募集接頭蛋白及IκBα降解。Nsp2可通過OUT結構域抑制I型IFN產生，OUT結構域能夠使泛素和ISG15與底物解離，而且Nsp2可通過未知機制負調控NF-κB激活，此外Nsp2可能干預磷酸化的IκB聚泛素化，導致IκB降解失活[7]。

4 PRRSV抑制JAK-STAT信號通路與ISG表達

PRRSV感染Marc-145細胞24 h后，抑制JAK-STAT通路，阻斷ISGF3核轉運。傳染性胃腸炎病毒刺激pDCs，STAT1的核轉運被PRRSV抑制，在此過程Nsp1β通過抑制STAT1磷酸化和IS?GF3核轉運發揮重要作用；酵母雙雜交試驗發現Nsp1α與PIAS1相互作用，PIAS1作為STAT1通路的負調控子和SUMO E3連接酶發揮作用；Nsp1α與PIAS1作用導致Nsp1α類泛素化，加速Nsp1α轉運入核[8]。Nsp2的OUT結構域具有去泛素化活性，在293T細胞中可降低泛素化與ISG化，表明病毒可通過Nsp2的早期解離逃避先天性免疫。綜上所述，在PRRSV感染早期，Nsp1、Nsp2和Nsp11加速病毒基因轉錄和蛋白質翻譯，然而通過抑制I型IFN產生和誘導IFN的信號通路，來抑制感染細胞的免疫反應。在感染后36～48 h，當感染進入晚期時，NF-kB通路被激活，有助于病毒在宿主體內的存活[9]。

5 PRRSV與細胞凋亡

豬感染后，PRRSV可導致感染細胞的鄰近細胞發生凋亡。GP5蛋白通過其N末端119個氨基酸序列作用B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的下游誘導細胞凋亡，Nsp4是一個關鍵的凋亡誘導劑，依賴于絲氨酸蛋白酶活性誘導凋亡。PRRSV感染豬肺泡細胞和來源于單核細胞的樹突狀細胞8 h，感染細胞趨于抗凋亡，但最終所有感染細胞由于凋亡和壞死全部死亡。病毒蛋白的表達對于誘導強烈的抗凋亡狀態非常必要，在感染的吞噬細胞內未檢測到結構蛋白以前，就檢測到由PRRSV介導的抗凋亡效應，所以非結構蛋白可能參與抑制凋亡[10]。病毒誘導的細胞凋亡和I型IFN的產生對于宿主抵抗侵入病毒的防御機制非常重要，因而PRRSV可能積極干擾細胞凋亡，部分原因可能病毒是抑制I型IFN的產生，尤其是在感染早期階段[11]。

IPS-1能夠誘導RIG-I信號通路，導致I型IFN表達及線粒體介導的細胞凋亡，研究表明，IPS-1作為I型IFN誘導與細胞凋亡的一個橋梁發揮作用。PRRSV的Nsp11與SARS-CoV的Nsp15同源，SARS-CoV的Nsp15是核糖核酸內切酶，不依賴于IRF3的激活，抑制IPS-1誘導的細胞凋亡，暗示抑制IPS-1導致抑制細胞凋亡可能是PRRSV逃避免疫的一種方式[12]。

6 結語

PRRSV可操縱TLR、RIG-I及JAK-STAT信號通路調控IFN產生，此外PRRSV還可激活或抑制包括NF-κB通路在內的其他通路；Nsp1、Nsp2和Nsp11等非結構蛋白也參與I型IFN產生的調控，目前已經鑒定出部分具有生物功能的結構域和基序。由于對PRRSV如何逃避宿主免疫反應的知識了解很少，導致對疾病控制不當。因此深入開展抑制I型IFN機制研究，鑒定IFN調節的活性位點，應用感染性cDNA構建基因突變株，消除病毒的免疫抑制功能，構建新型減毒疫苗株，可能是控制PRRS的可行方法。

[1]張松林，韓靜，李峰，等.豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的免疫學和免疫逃避研究進展[J].病毒學報，2012，28（6）:689-697.

[2]Miller L C，Lager K M，KehrliME.Role of Toll-like receptors in activation of porcine alveolarmacrophages by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Clin.Vaccine Immunol，2009，16（3）:360-365.

[3]Luo R，Xiao S，Jiang Y，etal.Porcine reproductive and respirato?ry syndrome virus（PRRSV）suppresses interferon-beta produc?tion by interfering with the RIG-I signaling pathway[J].Mol Im?munol，2008，45（10）:2839-2846.

[4]Li H，Zheng Z，Zhou P，etal.The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus non-structur?al protein 2 antagonizes interferon regulatory factor 3 activation[J].JGen Virol，2010，91（Pt12）:2947-2958.

[5]Calzada-Nova G，Schnitzlein W M，Husmann R J，etal.North American porcine reproductive and respiratory syndrome viruses inhibit type I interferon production by plasmacytoid dendritic cells[J].JVirol，2011，85（6）:2703-2713.

[6]Han M，Du Y，Song C，etal.Degradation of CREB-binding pro?tein and modulation of type I interferon induction by the zinc fin?germotif of the porcine reproductive and respiratory syndrome vi?rus nsp1α subunit[J].Virus Res，2013，172（1-2）:54-65.

[7]Sun Z，Chen Z，Lawson SR，etal.The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstruc?tural protein 2 possesses deubiquitinating and interferon antago?nism functions[J].JVirol，2010，84（15）:7832-7846.

[8]Wang R，Nan Y，Yu Y，etal.Porcine Reproductive and Respira?tory Syndrome Virus Nsp1βInhibits Interferon-Activated JAK/STAT Signal Transduction by Inducing Karyopherin-α1 Degrada?tion[J].JVirol，2013，87（9）:5219-5228.

[9]Sang Y，Rowland R R，Hesse R A，etal.Differential expression and activity of the porcine type I interferon family[J].Physiol Ge?nomics，2010，42（2）:248-258.

[10]Zhu L，Zhou Y，Tong G.Mechanisms of suppression of interferon production by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Acta Virol，2012，56（1）:3-9.

[11]Sun Y，Han M，Kim C，etal.Interplay between Interferon-Medi?ated Innate Immunity and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses[J].2012，4（4）:424-446.

[12]敬曉棋，孟建斌，高曉陽，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫抑制研究進展[J].動物醫學進展，2012，33（10）:75-78.