奶牛前三把奶中優勢病原菌的分離與藥敏分析

楊樹鑫，杜 軍，朱嬌玲

（1.寧夏吳忠市利通區動物衛生監督所，寧夏 吳忠751100；2.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川750021）

奶牛乳腺炎是奶牛養殖業中常見病之一，該病根據病原微生物的傳播特點分為兩類：第一類是接觸傳染性病原微生物，包括鏈球菌、金黃色葡萄球菌和支原體，這些病原菌殖于乳腺并通過擠奶工或擠奶機傳播；第二類為環境性病原體，主要包括革蘭陰性菌、凝固酶陰性葡萄球菌、環境鏈球菌、酵母等，此類病原菌主要由于奶牛乳房容易沾有大量細菌，這些細菌極易進入乳導管，在此生長繁殖[1-2]。目前對乳腺炎的研究重點主要集中于對患病奶牛病原菌的藥敏分析、病理特點[3]、炎癥因子、血清型和毒力因子[4]等的方面，極少有對擠奶和實驗前棄掉的前3把奶中的病原菌進行規范化的研究，而奶牛前3把奶中含有大量的細菌種類，這些細菌嚴重影響著鮮奶的品質、幼畜的健康成長以及患病奶牛中病原菌的檢測和研究。因此本實驗對正常產奶奶牛前3把乳樣進行病原菌的分離、鑒定及藥敏分析，為奶牛乳腺炎的預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 質控菌株：鏈球菌ATCC32210、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922，均購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

隨機對吳忠市6個規模化奶牛場采集奶樣，采集正常奶牛前3把奶中乳樣95份，用無菌試管接取5mL，加蓋封緊，標明牛號、采樣日期，樣品采集后，置于冰盒中，于12 h內送到實驗室，并立即處理和檢測。

營養肉湯，普通營養瓊脂，高鹽甘露醇培養基，伊紅美藍培養基，麥康凱培養基，馬丁瓊脂培養基等，購自杭州天和微生物試劑有限公司；葡萄球菌選擇性瓊脂110，三糖鐵培養基，細菌微量生化鑒定管等，購自青島高科園海博生物技術有限公司。

藥敏紙片：頭孢唑啉（CZ）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、環丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、四環素（TE）、青霉素（P）、阿米卡星（AN）、頭孢西丁（FOX）、慶大霉素（GM）、多西環素（DO）、磺胺甲硝唑/甲氧芐啶（SXT），均購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

1.2 方法

1.2.1 平板菌落計數法 隨機從每個奶牛場抽取3個樣品，每個樣品取50μL乳樣于5mL肉湯培養基中37℃，150 r/min震蕩培養18 h，然后將菌液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，終體積為1mL，最后分別涂布于營養培養基上培養24 h，每個稀釋梯度重復3次，隔天觀察菌落數目，選擇長有50～200個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量。計算公式如下：

每毫升樣品中菌落形成單位數（CFU）=同一稀釋度3次重復的平均菌落數×稀釋倍數×5。

1.2.2 病原菌的分離培養及形態觀察 將采集的乳樣充分搖勻后，分別用接種環接種于肉湯培養基中，37℃，培養24 h。然后于營養瓊脂平板、伊紅美藍平板、麥康凱平板、甘露醇高鹽平板劃線37℃，24～48 h培養后，觀察細菌的培養特性。根據菌落的形態特征，將不同菌落的菌分別接種于肉湯培養基中培養24 h后，劃線于營養瓊脂平板上通過革藍染色區分出革藍陽性菌和革藍陰性菌，以及球菌和腸桿菌，通過觸媒試驗區分出葡萄球菌和鏈球菌，從而結合不同細菌在鑒別培養基中的生長情況初步判定細菌的類屬[5]。

1.2.3 病原菌的鑒定試驗

1.2.3.1 甘露醇發酵產酸試驗 將已分離純化好的葡萄球菌在葡萄球菌屬選擇培養基上劃線培養24 h后，用0.04%溴麝香草酚藍指示劑滴加于菌落，如變為黃色，即為陽性。

1.2.3.2 明膠液化試驗 將已分離純化好的葡萄球菌在葡萄球菌屬選擇培養基上劃線培養24 h后，將硫酸銨飽和水溶液滴加于菌落，10min后，如圍繞菌落出現一清晰帶，即為陽性。

1.2.3.3 生化管鑒定試驗 將已分離并純化培養的各種細菌劃線于營養培養基上，18～24 h，37℃培養。挑取單個菌落于微量生化管內，培養24～48 h，觀察生化管內顏色的變化，并同時以鏈球菌ATCC32210、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株。

1.2.4 藥敏試驗 將分離鑒定的革蘭陰性桿菌和葡萄球菌直接接種于普通肉湯培養基，鏈球菌接種于血清肉湯培養基，37℃，24 h培養。用培養基稀釋至0.5麥氏比濁度，將棉簽浸泡在菌液中10min后均勻涂布在培養基上，溫室下放置5min，使表面的菌液稍干燥，然后用無菌鑷子將13種藥敏紙片分別貼到平板上，在培養箱37℃培養24 h后測量抑菌圈直徑，判定試驗菌株對各種抗生素的敏感度。每株試驗3次，取其抑菌圈值的平均值[6]。

2 結果

2.1 牛奶中細菌總數 采用平板菌落計數法對6個奶牛場中前3把奶中的細菌總數進行測定，結果顯示，牛場1、牛場2、牛場3、牛場4、牛場5和牛場6中細菌總數分別達到2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、2×108CFU/mL、4×108CFU/mL、3.5×108CFU/mL和2.5×109CFU/mL。通過以上數據可知，這6個奶牛場中正常產奶牛前3把奶中的細菌數明顯高于鮮奶細菌總數（低于2×105CFU/mL）質控指標[7]。

2.2 病原菌培養及形態特性

2.2.1 大腸埃希菌 在營養瓊脂平板上為白色大菌落，在麥康凱平板上形成中等大小、表面光滑、濕潤的紅色菌落，在伊紅美藍平皿上為黑色帶有金屬光澤菌落，在三糖鐵培養基上斜面和底部均為黃色，革蘭染色油鏡下為短桿狀單個或成對存在的革蘭陰性菌，則可初步判斷為大腸埃希菌[8]。

2.2.2 葡萄球菌 在營養瓊脂培養基上生長良好，在高鹽甘露醇培養基上凝固酶陽性菌形成金黃色、光滑、隆起的中等大小菌落，且通過甘露醇發酵產酸試驗、明膠液化試驗、凝固酶試驗和觸媒試驗均為陽性，則可初步確定為金黃色葡萄球菌。凝固酶陰性菌在高鹽甘露醇培養基上呈紅色、光滑、隆起的中等大小菌落，甘露醇發酵產酸試驗、明膠液化試驗和凝固酶試驗為陰性，觸媒試驗為陽性[9]。

2.2.3 鏈球菌 在營養瓊脂和麥康凱平板上生長不良，在馬丁瓊脂平板上生長良好，菌落為露滴狀、圓形、隆起、透明、表面光滑、濕潤的小菌落，凝固酶試驗和觸酶試驗均為陰性，革蘭染色后在油鏡下成雙或短鏈狀、長鏈狀排列則可初步判斷為鏈球菌[10]。

2.3 病原菌的生化特性 主要病原菌的生化特性結果見表1。結合不同菌株的生化特性、培養特性及形態特征，判定菌株的類型為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌。

表1 主要病原菌的生化鑒定結果

2.4 細菌的分離培養與鑒定 95份乳樣中有78份乳樣檢測出有細菌生長，共分離得到4種優勢病原菌共102株，其中62株大腸埃希菌，檢出率為65.3%；33株金黃色葡萄球菌，檢出率為37.3%；鏈球菌7株，檢出率為6.9%。結果表明，這些分離菌廣泛存在于該地區奶牛場的正常牛群中。

2.5 藥敏試驗結果 通過K-B法測定分離菌株的耐藥情況顯示，所分離的菌株對臨床常用的抗菌藥存在一定程度的敏感性，且多數菌株僅對青霉素存在嚴重的耐藥性。耐藥率從高到低依次為：青霉素、慶大霉素、四環素、磺胺甲氧嘧啶、卡那霉素、環丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、頭孢西丁、多西環素、阿莫西林、頭孢唑啉（表2）。

結果判斷，依據《抗菌藥物敏感性試驗執行標準（第十七版信息增刊）》進行[11]。

6個牛場中臨床分離株的耐抗生素情況如圖1和表2所示，102株分離株對臨床常用抗生素多表現為耐1-2種抗生素，且對環丙沙星和頭孢唑啉存在一定程度的敏感性，其敏感率達到96.7%，但各菌株均對青霉素存在很大程度的耐藥性，其耐藥率達到了100%。

表2 抗生素對臨床分離菌株的敏感性

3 討論

奶牛乳腺炎嚴重危害著奶牛養殖業的發展，主要表現在產乳量，廢棄牛奶，治療成本以及勞動力等方面。近年來，隨著奶牛乳腺炎發病率的逐年增高，廢棄牛奶的量也越來越大，其主要原因是此類牛奶不但影響著奶牛自身的健康同時，也影響著鮮奶的品質以及幼畜的健康成長。而通常在擠奶過程中，由于前3把奶中含有的細菌數比較高，且奶牛喜歡臥地反芻和休息，接觸地面（特別是當地面較污濁時）的奶牛乳房容易沾有大量細菌，而從乳頭開始到乳房內部有一個乳導管，細菌容易進入乳導管，并在此生長繁殖。因此首先要棄掉前3把奶，然后用一定比例的消毒水噴灑乳頭，再用高溫消毒過的毛巾，一對一的擦干凈奶牛的乳房開始擠奶。并且對棄奶要用專門容器收集，這樣可以避免廢棄在地面上的牛奶污染環境，導致病原微生物傳播感染；也能更容易在專門的容器里觀察牛奶中是否有凝塊、絮狀或水樣奶，以及時發現臨床乳房炎，做到及時治療并防止患乳房炎的牛奶混入正常奶中。

圖1 不同細菌耐受抗生素種類分布

本試驗從6個規模化奶牛場中，隨機采集正常產奶奶牛前3把奶樣95份，對此95份乳樣進行細菌總數的測定，發現前3把奶中細菌的總數明顯高于鮮奶中細菌的總數，這提示著我們如果不合理的控制此類病原菌的生長和繁殖，將會增加奶牛患各種疾病的概率。通過對病原菌的分離鑒定中可以了解到，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌為前3把奶中的優勢病原菌，這些病原菌通常是引起奶牛患乳腺炎和其他疾病的重要致病菌[13]。所分離的102株病原菌藥敏試驗結果表明，環丙沙星、頭孢唑啉、阿莫西林、多西環素、頭孢西丁、阿米卡星等藥物對這6個規模化奶牛場中前3把奶中優勢病原菌具有高度的敏感性。在本試驗結果中，約100%的分離株對青霉素高度耐藥，這與6個奶牛場常用青霉素作為臨床治療藥物的結果相一致，且與張珠明對此地區的研究結果相似[14]。因此，可根據本試驗的結果選擇環丙沙星等抗生素類藥物用于治療該地區奶牛乳腺炎等疾病。同時通過此次試驗可以發現，雖然目前對引發奶牛乳腺炎的病原菌的研究較多，但為了更好的預防和控制奶牛乳腺炎的產生，需盡早對未患病的正常牛群中病原菌的分布特點、病原菌的種類及耐藥程度進行研究，從而在細菌未感染到奶牛乳房內而將其殺死，降低奶牛乳房炎等疾病的發生。

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