恩諾沙星對大腸桿菌突變耐藥菌產生和富增影響的研究

吳 昊，楊雨輝，2，王學梅，王金花，趙建國

（1.海南大學農學院，海南 海口570228；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南 海口570228）

雖然科學家們發現細菌耐藥性現象僅有60多年的歷史，但最近的研究卻表明，它是一個古老的自然現象[1]。正是由于當前抗菌藥物大量使用，破壞了原有微生物之間形成的平衡，才導致目前大量耐藥菌的出現。雖然我們已經能夠確定，耐藥性是細菌適應性進化的結果，但是，仍有一些疑問需要解決，那就是為什么細菌耐藥性的進化速度如此之快？又有哪些因素影響著耐藥菌的進化速度呢？

從目前關于耐藥菌進化影響因素的文獻來看，耐藥菌的產生速度，受到抗菌藥物濃度變化和空間分布的影響[2-4]。而耐藥菌的選擇性富增過程受到抗菌藥物濃度變化的影響[5-9]。抗菌藥物的濃度變化和空間分布可對細菌生存形成強度不同的壓力，從而影響細菌耐藥性的進化過程。不同的給藥方案和藥物代謝動力學特征是造成動物體內藥物濃度變化的兩個最主要因素。因此，通過改變給藥方案和藥物代謝動力學特征，可以實現動物體內藥物濃度的變化，從而影響細菌耐藥性的進化過程。由于給藥方案是耐藥菌進化影響因素中人為可控的因素，因此，我們對抗菌藥物給藥方案制定的要求不僅僅是高效和低毒，更要求給藥方案能夠遏制耐藥菌的進化速度，防止或減慢耐藥菌的產生和富增。

由于傳統給藥方案的制定，僅是考慮療效，而忽略了給藥方案對耐藥菌產生和富增的影響，因此，僅根據體外最小抑菌濃度（MIC）、消除半衰期和有效濃度維持時間等方法，確定的給藥方案已不能滿足目前我們對抗菌藥物給藥方案制定的要求。為了制定更為合理的給藥方案防止耐藥菌過快地產生和富增，開展給藥方案對細菌耐藥性產生與發展影響的研究是非常必要的。針對于此，利用體外藥物代謝動力學模型研究了恩諾沙星不同給藥方案對大腸桿菌耐藥菌產生和富增的影響，以期確定給藥方案和藥動學特征在耐藥菌產生和富增所產生的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 恩諾沙星精制品，由浙江國邦藥業有限公司生產，批號：070822-1，含量≥98%；恩諾沙星標準品，批號：H0080306，購自中國獸醫藥品監察所；乙腈和甲醇為色譜純，氯化鈉，磷酸等均為國產分析純試劑；肉湯培養基和營養瓊脂培養基，均購自廣州環凱微生物科技有限公司。

1.2 待測菌株 大腸桿菌標準菌株2081（44103），購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度的測定 本研究采用試管雙倍稀釋法測定MIC，加菌量為105CFU/mL。37℃培養16 h～18 h后觀察結果。以最低不長菌的濃度為MIC。相同過程重復5次。

1.3.2 防突變濃度（Mutation prevention concentration，MPC）的測定 分別以2MIC、4MIC、8MIC、16MIC濃度的抗菌藥制作藥物平板，濃縮菌液并調整濃度。每個藥物平板接種0.1mL菌液，每個藥物濃度4個平板，使每個濃度最終接種菌的量達到1.2×1010CFU。37℃下培養72 h，觀察結果，最低不長菌的濃度為暫定防突變濃度（MPCpr）。在MPCpr的基礎上線性遞減20%制作藥物平板，以相同的方法接種細菌。最低不長菌的濃度就是防突變濃度（MPC）。

1.3.3 體外藥物代謝動力學模型的建立 體外藥物代謝動力學模型的建立及參數的確定方法參見楊雨輝報道的方法[10]，本研究也是使用兩個流速相同的蠕動泵來實現一室模型室內藥物濃度的指數變化。其中恩諾沙星豬體內的消除半衰期參考曾振靈[11]的報道，蠕動泵的流速根據藥物的消除半衰期進行確定，流速=容器體積（V)×Kel；Kel=0.693/消除半衰期。

1.3.4 模型內大腸桿菌總數及不同耐藥強度大腸桿菌的計數方法 模型內大腸桿菌的總數采用無藥平板菌落計數法進行細菌計數。不同耐藥強度大腸桿菌的測定采用含1MIC、2MIC、5MIC、8MIC的恩諾沙星的藥物濃度平板進行菌落計數進行計數。

1.3.5 試驗方案及試樣采集 首先制作體外藥物代謝動力學感染模型，從平板上挑取單個菌落接種于5 mL肉湯中，適宜溫度培養12 h后，取0.1 mL菌液接種于模型雙層燒杯的肉湯中，培養12 h后，即為制作的體外藥物代謝動力學感染模型。模型的給藥劑量分別設定為0.15μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.80μg/mL、1.50μg/mL；半衰期分別設定為3 h或6.5 h，給藥間隔是12 h。加入抗菌藥物，使肉湯中的藥物達到所需的初始濃度。在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h分別取出菌液進行細菌計數。試驗模型的運行時間根據模型內細菌的耐藥強度和數量進行調整，當模型內所有細菌均為超過8MIC耐藥的強度時或模型內所有的細菌均被殺死時，試驗結束。每個采樣點均使用有無藥平板和含藥分別是1MIC、2MIC、5MIC、8MIC的藥物平板進行計數。同時取2 mL菌液裝在2個小離心管中放在冰箱中冷凍保存，以便進行藥物濃度的測定。每個初始濃度重復3次。

1.3.6 模型內藥物濃度的測定方法 本研究采用高效液相色譜法測定恩諾沙星的藥物濃度，具體方法參見文獻[8]。

1.3.7 數據處理 本試驗平均值及標準差的計算使用Microsoft Excel、藥動參數的計算使用WINNONLIN軟件進行。

2 結果

2.1 恩諾沙星對大腸桿菌的MIC和MPC 經測定，恩諾沙星對大腸桿菌標準菌株2081（44103）的MIC值為0.015μg/mL，MPC值為0.1μg/mL，MIC/MPC為6.667。突變選擇窗（Mutation Selection Windows，MSW）的范圍在0.015μg/mL至0.1μg/mL之間。

2.2 恩諾沙星不同的給藥方案對大腸桿菌突變耐藥菌產生和富增影響的結果 恩諾沙星不同的給藥方案對大腸桿菌突變耐藥菌產生和富增影響的結果見表1～6，其中，表1～3是藥物消除半衰期為3 h和給藥間隔為12 h的情況下，給藥劑量分別為0.20μg/mL，0.30μg/mL和0.80μg/mL的試驗結果。由于給藥劑量為0.15μg/mL的處理出現耐藥規律一致，故此省略。表4～5是給藥間隔為12 h，藥物的半衰期為6.5 h，給藥劑量分別為0.20μg/mL和0.80 μg/mL的試驗結果。由于給藥劑量為1.5μg/mL的處理與給藥劑量為0.80μg/mL的處理結果均全部殺死細菌，故此省略。

由結果可見，在藥物消除半衰期和給藥間隔相同的情況下，如果藥物不能殺滅全部的病原菌，則給藥濃度越高，耐藥菌出現越早，且耐藥強度越高。在藥物濃度和給藥間隔相同的情況下，藥物消除越快，就更早地富集出耐藥菌。耐藥菌的耐藥強度隨著用藥時間的延長而增強，且有階梯增強的表現。在藥物濃度高到一定的值時，細菌會被全部殺死。且即使再提高藥物濃度，也不能再加快殺滅細菌的速度。

2.3 不同設定條件的藥物代謝動力學模型的藥動學參數 使用WINNONLIN軟件的一室靜注模型對藥物代謝動力學模型內藥物濃度的變化進行模型計算，結果見表6。結果表明，計算得到的藥動學參數與事先設置的參數接近，藥物濃度的變化規律可用方程C=C0×e-Kelt表示。其中C0：初始藥物濃度；t：模型運行的時間。

3 討論

由結果可見，在藥物消除半衰期和給藥間隔相同的情況下，如果藥物不能殺滅全部的病原菌，則給藥濃度越高，耐藥菌出現越早，且耐藥強度越高。在藥物濃度和給藥間隔相同的情況下，藥物消除越快，就更早地富集出耐藥菌。耐藥菌的耐藥強度隨著用藥時間的延長而增強，且有階梯增強的表現。在藥物濃度高到一定的值時，細菌會被全部殺死。且即使再提高藥物濃度，也不能再加快殺滅細菌的速度。

表1 在T1/21）=3 h，按D2）=0.2μg/m L及T3）=12 h的方案給藥后模型內藥效及耐藥菌組成的變化

表2 在T1/2=3 h，按D=0.3μg/m L及T=12 h的方案給藥后模型內藥效及耐藥菌組成的變化

表3 在T1/2=3 h，按D=0.8μg/m L及T=12 h的方案給藥后模型內藥效及耐藥菌組成的變化

由以上結果說明，耐藥菌的出現和富集與給藥方案和藥物的藥動學特征都有關系，這是在以前的研究中很少被論述的內容，但是，最近也有部分文獻對耐藥菌產生的影響因素進行了論述。2011年Zhang Q等[2]在Science上發表了一篇關于耐藥菌出現影響因素的文章，該研究使用一個微流裝置，研究了環丙沙星濃度梯度對大腸桿菌耐藥菌出現的影響，結果表明，藥物空間分布的不均一性是加速耐藥菌進化的一個因素。之后又有幾篇關于藥物濃度梯度對耐藥菌進化影響的論述。Hermsen R[3]提出了一個定量的數學模型描述藥物濃度在動物體內的不均一性對耐藥菌進化的影響。結果表明，濃度梯度可以培育一個在均一環境中不可能存在的模型，這樣的模式使得突變耐藥株逃避了更高藥物濃度的包圍，結果更有利于耐藥菌的出現。Greulich P等[4]使用一個統計物理學模型研究了暴露在藥物濃度梯度下一群惡性細胞的進化過程。結果顯示，當耐藥菌突變路徑包括很多步驟的時候，藥物分布的不均一性具有加速耐藥性出現的可能性。但是，如果突變路徑很短或者僅需跨過一個障礙，耐藥性的出現很可能被藥物濃度梯度減慢。以上兩個論述是在數學模擬后的結論，需要實驗的驗證。

除了藥物空間分布影響耐藥菌出現的速度外，抗菌藥物的給藥方案和藥動特征也影響著耐藥菌出現的速度。2011年Jotam G[5]論述了耐藥結核菌的出現與PK/PD因素有關，并指出非優化的給藥方案是驅動結核菌對抗結核藥物產生耐藥性主要因素。在以前的一些研究中[6-8]，雖然沒有明確表明給藥方案和PK/PD特征將影響耐藥菌的出現速度，但研究結果表明在體外藥效的模型中，當藥物濃度處于MIC附近的時候，更容易導致耐藥菌的發展。這也間接說明給藥方案和藥動特征會對耐藥菌的產生速度產生影響。

表4 在T1/2=6.5 h，按D=0.2μg/m L及T=12 h的方案給藥后模型內藥效及耐藥菌組成的變化

表5 在T1/2=6.5 h，按D=0.8μg/m L及T=12 h的方案給藥后模型內藥效及耐藥菌組成的變化

表6 不同設定條件的藥物代謝動力學模型的藥動學參數

模型運行結果中，給藥濃度為1μg/mL、0.8 μg/mL，加藥周期為12 h，半衰期為6.5 h的給藥方案可以完全殺死細菌。這兩個給藥方案中，模型內藥物濃度一直維持在MPC之上。MSW理論認為只有藥物濃度持續維持在MPC之上時，才不會篩選出耐藥菌，所以該結論符合MSW理論。

4 結論

由本研究的結果可見，細菌耐藥性的產生是一個逐漸增高的過程，且按照一定的規律嚴格進行的。在以前的研究中已經能夠確定藥物濃度和藥物結構可對細菌靶位耐藥基因的突變產生影響[12-13]，并表現出一定的規律性。如對于喹諾酮類藥物，不同藥物濃度作用于結核桿菌和肺炎鏈球菌，將選擇出不同耐藥的等位基因。當兩種靶目標同時存在時（即拓撲異構酶Ⅳ和解旋酶同時存在時），突變體靶目標按照嚴格的順序產生[14-15]。這些都說明，耐藥性的產生是有規律的，但接觸藥物濃度的差異會導致耐藥性產生速度和程度發生變化。因此認為，給藥方案和藥動學特征對對耐藥菌的作用不僅僅只是富集那么簡單，更涉及耐藥菌的產生機制，而這樣的機制和原因則需要在以后的工作中進一步研究。

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