活性氧參與脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7活化誘導(dǎo)凋亡

張宸豪，王月華，王長文，周露露，李 妍

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林132013）

巨噬細(xì)胞以模式識別方式結(jié)合、捕獲、吞噬和殺傷細(xì)菌等病原體，細(xì)菌感染后，巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和NO迅速增加，上訴強(qiáng)氧化性物質(zhì)參與殺傷病原體[1-2]。除介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答外，巨噬細(xì)胞可提呈抗原啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并通過釋放細(xì)胞因子進(jìn)一步增強(qiáng)免疫效應(yīng)。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要致病成分，巨噬細(xì)胞Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）結(jié)合和識別LPS，可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)p38MAPKs、NFκB等信號的活化，促進(jìn)炎癥性細(xì)胞因子釋放[2-3]。通常情況下，感染后的免疫應(yīng)答為自限性過程，T、B淋巴細(xì)胞通過活化誘導(dǎo)凋亡（Activation induced cell death/apoptosis，AICD）調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。近年來，國內(nèi)外學(xué)者提出巨噬細(xì)胞也可通過AICD而限制炎癥的進(jìn)行性發(fā)展[2-3]。研究表明，細(xì)菌或LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS參與巨噬細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但ROS是否也參與巨噬細(xì)胞AICD尚未明確[1-2]。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型，分析ROS與LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞AICD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7細(xì)胞源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。JC-1線粒體膜電位（Mitochondrialmembrane potential，MMP）檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：C2006）和ROS熒光探針雙氯熒光黃乙酸乙酯（Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA），購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；1640培養(yǎng)液，購自Gibco公司；小牛血清，購自Hyclone公司；胰蛋白酶和EDTA，購自Sigma公司產(chǎn)品；姜黃素，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。PI和Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒，購自eBiocience公司。流式細(xì)胞儀型號為Epics XL(美國貝克曼公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 試驗(yàn)前1周，自液氮中取出凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后在如下條件下培養(yǎng)：含10%小牛血清1 640培養(yǎng)液、5%CO2、飽和濕度和37℃。用含0.5%胰蛋白酶和0.2%EDTA的消化液消化細(xì)胞，2到3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，按如下分組加入LPS或其他制劑：不同濃度的LPS（0，1，2，4μg/mL和8μg/mL）；LPS（0和8μg/mL與H2O2（0和100μmol/L）；LPS（0和8μg/mL與姜黃素（0和7.5μmol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，消化收集細(xì)胞并完成后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 活性氧檢測 取5×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次，100μL PBS重懸細(xì)胞，加入DCFH-DA儲(chǔ)存液，至其終濃度為5μmol/L，混勻后在37℃避光反應(yīng)30min，PBS洗2次后流式細(xì)胞儀分析。

1.4 細(xì)胞凋亡分析 取5×105個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次，取195μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC-標(biāo)記Annexin-V，室溫下避光反應(yīng)30 min；結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞2次，400μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入PI溶液5μL，5min后用流式細(xì)胞儀分析。

1.5 線粒體膜電位分析 取5×105個(gè)細(xì)胞，參考試劑盒說明書提供的方法，配制JC-1染色工作液和染色緩沖液（冰沐保存）。500μL JC-1染色工作液重懸細(xì)胞，37℃避光反應(yīng)30 min；離心后棄上清，染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次；500μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀FL1通道（525 nm）檢測細(xì)胞所發(fā)射的熒光。

2 結(jié)果

2.1 LPS對巨噬細(xì)胞ROS、MMP和細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS和MMP。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為DCFH，該物質(zhì)被氧化后生成DCF，而DCF發(fā)射的熒光可采用流式細(xì)胞儀525 nm通道（FL1）來檢測,其熒光強(qiáng)度值代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。與對照組比較，1，2，4μg/mL和8μg/mL的LPS作用后，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平隨其濃度增加而增加（表1）。JC-1是一種新型熒光探針，進(jìn)入線粒體后，其存在狀態(tài)和發(fā)射熒光與線粒體功能聯(lián)系緊密：線粒體功能正常時(shí)，JC-1主要聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi)，形成聚合物，發(fā)射紅色熒光；而在MMP較低時(shí)，JC-1主要以單體形式存在，發(fā)射綠色熒光[4]。低濃度的LPS（1，2μg/mL和4μg/mL）對線粒體功能無顯著影響或具有弱的增強(qiáng)作用；當(dāng)LPS增加為8μg/mL，代表JC-1單體的綠色熒光增強(qiáng)，即MMP下降（表1）。

表1 LPS對RAW 264.7 ROS和MMP的影響

PI和Annexin-V試劑雙染法檢測細(xì)胞凋亡。圖中左下、左上、右上和右下象限分別代表活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、晚期凋亡和早期凋亡細(xì)胞，隨LPS濃度的增加，活細(xì)胞百分率下降；而凋亡和壞死細(xì)胞顯著增加（圖1）。

2.2 H2O2和姜黃素對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS的影響 采用H2O2（0和100μmol/L）或姜黃素（0和7.5μmol/L）與LPS（0和8μg/mL）處理RAW細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)分析ROS。與LPS單獨(dú)作用比較，H2O2導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加，而姜黃素降低細(xì)胞內(nèi)ROS（圖2）。

2.3 H2O2和姜黃素對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析H2O2和姜黃素對LPS活化巨噬細(xì)胞凋亡的影響。與LPS單獨(dú)作用比較，H2O2導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡、壞死的百分率增加，而姜黃素降低了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、壞死（圖3）。

3 討論

淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞）中存在AICD現(xiàn)象[5]。AICD參與中樞免疫器官中自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的克隆清除，淋巴細(xì)胞在外周淋巴組織被抗原活化后，也通過AICD而導(dǎo)致數(shù)量減少，從而避免過強(qiáng)的免疫應(yīng)答造成組織損傷。淋巴細(xì)胞發(fā)生AICD主要細(xì)胞膜表面的凋亡誘導(dǎo)配體和受體來介導(dǎo)，包括Fas和FasL，腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）和TNF受體，以及腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL）和其受體[6]。上述凋亡誘導(dǎo)配體和受體既是淋巴細(xì)胞執(zhí)行適應(yīng)性免疫功能的重要效應(yīng)分子，也清除免疫效應(yīng)細(xì)胞、限制炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。

圖1 LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞凋亡

圖2 H2O2和姜黃素對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS的影響

圖3 H2O2和姜黃素對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的影響

單核巨噬細(xì)胞由骨髓造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來，除介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答外，巨噬細(xì)胞可提呈抗原啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞在吞噬病原體、衰老變性細(xì)胞或粉塵等顆粒性異物后進(jìn)入活化狀態(tài)，表現(xiàn)為溶酶體功能增強(qiáng)、ROS和NO增加、分泌大量炎癥性細(xì)胞因子等[1-2]。與靜止巨噬細(xì)胞比較，活化后的巨噬細(xì)胞存活期縮短。病原體感染和其他非感染性炎癥疾病中，也可觀察到巨噬細(xì)胞凋亡增加，但其發(fā)生AICD的機(jī)制尚不明確。Toll樣受體（Toll like receptor 4，TLR4）是巨噬細(xì)胞識別細(xì)菌或LPS的主要膜受體，TLR4與LPS結(jié)合可導(dǎo)致各種組織內(nèi)巨噬細(xì)胞被激活。LPS誘導(dǎo)后，巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)的信號被活化，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)呼吸暴發(fā)產(chǎn)生大量ROS，但作為重要效應(yīng)分子的ROS是否也參與巨噬細(xì)胞的活化凋亡尚不明確。本研究證實(shí)，LPS以濃度依賴的方式誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡，伴隨LPS濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加；高濃度LPS導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生的同時(shí)也損傷了線粒體功能。向培養(yǎng)體系加入H2O2可增加細(xì)胞內(nèi)ROS，而本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2促進(jìn)了LPS所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。姜黃素具有抗氧化和治療腫瘤的功效[8]。用低濃度的姜黃素與LPS共同誘導(dǎo)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ROS比LPS單獨(dú)誘導(dǎo)組下降，細(xì)胞凋亡和壞死也有所減輕。概括而言，LPS誘導(dǎo)的ROS與巨噬細(xì)胞活化凋亡關(guān)系密切。

巨噬細(xì)胞的激活是其執(zhí)行免疫功能所必需的，但是激活后不受控制就可能造成正常組織細(xì)胞的損傷，研究巨噬細(xì)胞活化死亡的機(jī)制將有助于深入認(rèn)識其功能，為治療、預(yù)防自身免疫病和炎癥等疾病提供依據(jù)。

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