豬鏈球菌的分型鑒定及其體外形成生物被膜的研究

周永輝，王淑杰，黃全勇，陳儉清，李艷華

（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150001）

豬鏈球菌（Streptococcussuis，S.suis）已成為我國當前引起人獸共患病的一種重要的病原菌，可引起人畜的急性、熱性傳染病，會使人出現腦膜炎、關節炎、持久性聽力缺失,嚴重者可導致中毒休克綜合征并引起死亡。根據豬鏈球菌的莢膜多糖抗原可將其分為35個血清型，其中能引起人和動物發病的致病性豬鏈球菌血清型主要是1型、2型、7型和9型等。（Biofilm，B F）是細菌產生的多聚復合物基質將自身包繞，粘附于無活性物體或活體表面，形成的有一定結構的細菌群體；生物被膜內細菌容易對抗生素產生廣泛的耐藥性，造成感染難以治愈，反復發作[1]。國內學者證明，豬鏈球菌在體外可以形成生物被膜[2-3]。本試驗對13株從病料中分離出的豬鏈球菌進行分型鑒定，并對其生物被膜能力進行測定及形態觀察，為研究其致病性及生物被膜研究提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。THB培養基（青島高科園海博生物技術有限公司）。試劑：pH值7.4磷酸鹽緩沖溶液、結晶紫、甲醇、冰乙酸、犢牛血清、Taq DNA聚合酶（購自TaKaRa公司）；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。材料：卡爾加里生物膜裝置、96孔細胞培養板。檢測儀器：酶標儀（SN239591，美國Epoch）、掃描電鏡（S-3400N，日本）、PCR儀（S1000TMThermal Cycler，美國）。

1.2 試驗菌株培養及表型特征觀察 首先將豬鏈球菌菌株于無菌條件下在THB瓊脂平板上傳代II代進行純化分離，然后從THB瓊脂平板上挑取單個菌落，接種于無菌THB液體試管中，37℃恒溫培養箱中培養16 h后，取適量菌液稀釋進行革蘭染色，顯微鏡下觀察。

1.3 生化試驗 純培養后的細菌進行甘露醇、山梨醇、菊糖、棉子糖和蜜二糖發酵試驗，馬尿酸鹽試驗，精氨酸和透明質酸酶水解試驗，6.2%NaCl生長試驗等。結果參照文獻[4]的介紹進行判定。

1.4 豬鏈球菌的PCR鑒定及分型 豬鏈球菌鑒定引物及血清1型2型7型和9型豬鏈球菌的分型引物由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所設計，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。用常規方法對細菌DNA進行小量制備。常規PCR反應，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.5 生物被膜的培養及形成能力測定 按照1.2方法培養細菌2代，比濁法將菌液濃度先調整為0.5麥氏管懸液（1.0×108CFU/mL），再用THB液體培養基稀釋，使菌液濃度為1×106CFU/mL。每孔200μL菌液加到卡爾加里裝置底部板內，只含THB液體培養基的孔為陰性對照組，邊孔加生理鹽水為空白對照，37℃，45 r/min搖床上培養。參照Stepanovic[5]的方法測定生物被膜的形成能力。PBS清洗3次，固定，染色，測OD595值。

1.6 S.suis生物被膜的形態學觀察 首先從卡爾加里生物被膜裝置上取下形成生物被膜的樁釘，并使用滅菌PBS洗滌3次以去除游離菌，用戊二醛固定，脫水處理，用冷凍干燥儀對樣品進行干燥4 h。樣品表面在真空條件下鍍一層厚100A的金屬膜，SEM下觀察。

1.7 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對相關數據進行統計分析，結果用均值±標準差表示，統計資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 S.suis菌落及染色結果 細菌在未加犢牛血清的THB培養基平板上菌落為微小且透明，在加入血清的THB培養及平板上呈中等大小、光滑圓潤不透明。在顯微鏡下可看到細菌呈藍紫色長鏈狀。

2.2 生化試驗 13株菌株在菊糖、棉子糖和蜜二糖試驗中呈陽性，甘露醇和山梨醇中為陰性，馬尿酸鹽中為陽性，精氨酸中為陽性，透明質酸酶試驗為陰性，在6.2%NaCl中不生長，以上生化結果符合豬鏈球菌生化指標。

圖1 豬鏈球菌顯微鏡下形態 （1 000×）

2.3 豬鏈球菌PCR鑒定及分型結果 13株菌擴增均得到689 bp的gdh目的基因（圖2A）。其中1型引物擴增出約441 bp的片段，1號菌為1型豬鏈球菌（圖2B）；其中2型引物擴增出約675 bp的片段，11號、12號菌為2型豬鏈球菌（圖2C）；其中7型引物擴增出約335 bp的片段，2號、10號菌為7型豬鏈球菌（圖2D）；其中9型引物擴增出約388 bp的片段，3、5、6、7號菌為9型豬鏈球菌（圖2E）。

圖2（A-E）豬鏈球菌PCR擴增結果

2.4 生物被膜的培養及形成能力測定結果 參照Stepanovic[5]的標準，13株豬鏈球菌均可形成生物被膜，1號、2號、3號、4號、7號、9號、10號、12號、13號菌OD595數值介于陰性對照組OD595（0.203±0.016）值的1倍到2倍之間，差異顯著（P＜0.05），形成生物被膜能力較弱[5]；5號、6號、8號、11號菌OD595數值大于2倍陰性對照組OD595數值，但小于4倍陰性對照組OD595數值（0.203±0.016），差異顯著（P＜0.01），形成生物被膜能力中等[5]。

圖3 豬鏈球菌形成生物被膜測定結果（n=16，±SD）

2.5 S.suis生物被膜的形態學觀察 通過掃描電鏡觀察了生物被膜的形態學，結果見圖4。細菌鑲嵌于生物被膜中，細菌周圍有厚厚的黏液層。這些外觀形態表明細菌形成了生物被膜，且形成生物被膜可從外觀觀察到有的形成生物被膜致密，有的則稀疏。

圖4 S.suis生物被膜作用的形態學觀察 （5μm）

3 討論

豬鏈球菌病作為集約化豬群的主要傳染病之一,受到越來越多養豬業者的重視[6]。豬鏈球菌按照莢膜抗原的差異可分為35個血清型（1～34，1/2）[7]。其中1型、2型、7型、9型是主要流行的致病血清型。

據報道豬鏈球菌的gdh基因具有保守性[8-9]，因此此次設計引物特異性的鑒定出豬鏈球菌，本試驗對分離到的13株豬鏈球菌進行了致病性血清型鑒定，并成功鑒定出了1型1株，2型2株，7型2株，9型4株，為后續研究其毒力因子及其他特性做基礎。對13株豬鏈球菌進行生物被膜培養，結果13株全部能形成生物被膜，根據豬鏈球菌生物被膜的形成能力判定標準[10]：臨界值（OD c）約為陰性對照。當OD≤OD c時，判定細菌無生物被膜形成能力；當OD c＜OD≤2×OD c時，判定細菌生物被膜形成能力較弱；當2×OD c＜OD≤4×OD c時，判定細菌生物被膜形成能力中等；當4×OD c＜OD值時，判定細菌生物被膜形成能力強。根據判定標準形成生物被膜能力1號、2號、3號、4號、7號、9號、10號、12號、13號菌較弱，5號、6號、8號、11號菌中等，這些結果可能與菌體自身毒力基因及QS系統的調節有關[11]。生物被膜危害巨大，可造成細菌強力耐藥性并且造成交叉感染，難于治理，所以亟待對其更深一步研究，找出對策對其進行清除治理。

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