錦鯉皰疹病毒-CJ株ORF126 基因的原核表達及免疫試驗研究

王 好，王秋舉，劉艷輝，張雅斌，呂文亮，周井祥

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.吉林省水產科學研究院，吉林 長春 130033）

我國作為亞洲主要的鯉魚養殖國家，其產量占全球的70%。因此改進鯉魚的養殖方法增加產量是解決全球糧食問題的一個重要途徑[1-2]。但是20 世紀90 年代早期暴發的一種高度傳染和急性致死的疾病給全球的鯉魚養殖業帶來了巨大的經濟損失[3]。這種疾病的快速傳播可能與國際間的魚類貿易有關[4]。根據病毒的形態學特征這種疾病最初被命名為錦鯉皰疹病毒[5]。由于這種病毒主要損害鯉魚的鰓和腎，因此又將這種病毒命名為鯉魚間質性腎炎和鰓壞死性病毒[5]。最近，基于該病毒的基因組與其他鯉科皰疹病毒的同源性建議將該病毒命名為鯉科皰疹病毒3 型（CyHV-3）[6]。

自從該病于20 世紀90 年代在美國、歐洲以及以色列暴發以來[4，7-9]，CyHV-3 已經成為鯉魚主要的疾病之一[3，10-12]。2002-2003 年期間，CyHV-3 造成日本[13]，印度尼西亞[10]和臺灣[12]等亞洲許多國家和地區養殖鯉魚的大量死亡。該病的發生與溫度有密切的關系，該病主要發生在水溫18 ℃～28 ℃的春秋季，當水溫上升到30 ℃時很少發病，這可能是因為在這個溫度時病毒的增值和基因轉錄停止[14]。

由于KHV的高感染率和死亡率造成的巨大經濟損失，但目前為止還沒有有效地藥物來治療本病。所以疫苗免疫就顯得尤為重要。本試驗選擇錦鯉皰疹病毒糖蛋白基因ORF126 作為研究對象，對其進行原核表達和相應的免疫原性的研究為錦鯉皰疹病毒的預防探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ）系由吉林農業大學重點實驗室分離保存[15]；錦鯉尾鰭細胞系由吉林農業大學重點實驗室培養保存；ELISA試驗兔抗魚二抗為實驗室自制；500-600 g健康鯉魚，購自未發生KHV的長春某漁場，抽檢部分魚，經PCR檢測KHV陰性。新生牛血清、M199 培養基，購自GIBCO公司；ExTaqDNA聚合酶、限制性內切酶EcoRI 和HindⅢ、DNAMarker，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；鎳離子金屬鰲合親和層析介質（Ni-NTA），購自上海銳谷生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 載體與菌株 pMD18-T 購自寶生物工程（大連）有限公司，E.coli.DH5α購自北京全式金生物技術有限公司。pET-32a 為本實驗室保存。

1.3 引物的設計與合成 從GenBank（登錄號:AP008984.1）上下載KHVORF126 的全基因序列，用軟件Primer Primer 5.0 設計1 對引物，上游引物（F1）為：5′-GAATTCATGATGAGGATCCTTCTGCTA-3′，下游引物（F2）為：5′-AAGCTTCTAAGCCGTGATCAGGTC-3′，分別在引物上、下游的5′端加入EcoRI 和HindⅢ酶切位點（劃線部分）；引物設計完成后送至上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）ORF126基因的擴增 將本實驗室保存的錦鯉皰疹病毒中國吉林株接種在鯉魚尾鰭單層細胞上，每日觀察細胞的病變情況，當病變達到70%～80%時收集病毒，按照常規方法提取病毒的DNA，應用25 μL 反應體系進行PCR擴增，反應條件如下：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。35個擴增循環，最后，反應體系于72 ℃中延伸10 min，結束反應后4 ℃保存。

1.5 錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因的克隆與鑒定 將目的片段純化回收后在4 ℃下與pMD18-T 載體過夜連接后；將連接產物全量轉化入DH5α感受態細胞中，用含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養基篩選單菌落，提取質粒后用PCR鑒定（PCR 程序如上）和EcoRI 和HindⅢ進行雙酶切鑒定，命名為pMD18-T-ORF126，陽性質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6 錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因原核表達載體的構建 將pMD18-T-ORF126 和pET-32a 分別用EcoRI 和HindⅢ雙酶切，純化回收目的片段后，16 ℃過夜連接，連接體系為：目的片段：10 μL，pET-32a 大片段：1 μL，10 倍T4 Buffer：1 μL，T4 DNA連接酶：1 μL，ddH2O：1 μL，總體系為15 μL。

1.7 錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）ORF126基因原核表達載體的鑒定 將連接產物總量轉化化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，用含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養基篩選單菌落，提取質粒后分別用PCR（PCR 程序如上）和用EcoRI 及HindⅢ雙酶切進行鑒定，陽性質粒命名為pET32a-ORF126。

1.8 重組質粒的誘導表達 將鑒定正確的陽性質粒pET32a-ORF126 轉化入大腸桿菌BL21 中，用含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養基篩選單菌落，挑取單個菌落接種于含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃過夜培養后，按1%接種于新鮮的LB液體培養基中培養，37 ℃震蕩培養至OD600為0.6 時，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L 誘導表達2～4 h。SDS-PAGE 電泳后考馬斯亮藍染色觀察。

1.9 表達蛋白的純化及蛋白質濃度的測定 將表達后的菌液反復凍融3 次用Ni-Denature-GuHCl 裂解表達菌，經超聲破碎后利用Ni-NTA-瓊脂糖凝膠層析柱進行純化。

用分光光度計測定蛋白質的濃度，分別在OD280nm 和OD260nm 的光密度下測定蛋白質的濃度。

1.10 抗體水平檢測 將純化后的蛋白1∶1 加不完全佐劑，按10 μg/mL，20 μg/mL 和40 μg/mL 的濃度分別免疫3 組魚，同時設置空白和生理鹽水兩組作為對照組，每組10 條魚。分別在免疫后4，7，10，14，18，24 d 和28 d 采血收集血清，用間接ELISA檢測抗體的水平。

2 結果

2.1 錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因的擴增 PCR 擴增出一條與目的基因大小一致的片段（圖1）。

圖1 錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）ORF126基因PCR擴增

2.2 錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ）重組質粒pMD18T-ORF126 鑒定 PCR擴增出1 條與目的基因大小一致的片段。pMD18-T-ORF126 用內切酶EcoRI 和HindⅢ雙酶切后獲得1 條大小約為822 bp 的片段，說明ORF126 基因已成功克隆到載體中。

2.3 重組質粒pET32a-ORF126 鑒定

2.3.1 PCR 鑒定 用提取的重組質粒pET-ORF126作為模板進行PCR 擴增，結果獲得了長為822 bp 的片段，與目的基因大小一致。

2.3.2 酶切鑒定 對重組質粒pET-ORF126 用EcoRI 和HindⅢ雙酶切后得到與ORF126 大小一致的一條822 bp 的片段和一條大于822 bp 的片段。

2.4 重組蛋白的表達 ORF126 表達蛋白的理論大小為29.9 kDa，pET-32a 自帶20 kDa 左右的融合蛋白，重組蛋白的總分子量為49.9 kDa；誘導表達后的重組蛋白經SDS-PAGE 分析，如圖2，誘導的樣品在51 kDa 左右有1 條蛋白帶，與理論結果相符。

2.5 純化蛋白的濃度 鎳柱純化的蛋白經分光光度計測定重組質粒pET32a-ORF126 表達蛋白的濃度為0.416 mg/mL。

圖2 pET32a-ORF126的IPTG誘導表達

2.6 抗體水平 用間接ELISA檢測不同天數的抗體水平見表1。

表1 鯉魚血清ELISA抗體水平檢測 （OD450）

用不同劑量蛋白免疫后均可檢測到KHV的抗體。表1 數據經t檢驗，用pET32a-ORF126 表達的蛋白10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗體水平差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同劑量表達蛋白免疫鯉魚血清ELISA抗體水平檢測結果

3 討論

錦鯉皰疹病毒病已經給我國的鯉魚養殖業造成了巨大的經濟損失。目前，還沒有藥物能夠治療本病，免疫接種是預防本病發生和傳播的有效途徑。因此，必須研究更安全有效地疫苗。

本試驗經克隆獲得了長為822 bp 的ORF126基因的全基因序列,將錦鯉皰疹病毒（KHV）囊膜蛋白基因ORF126 將其克隆至pET32a 中，構建了重組載體并轉化入大腸桿菌BL21 中，經IPTG 誘導，SDS-PAGE 結果顯示，插入的外源基因在大腸桿菌中表達出約為49.9 kDa 融合蛋白。用純化的蛋白免疫魚后用間接ELISA檢測抗體水平；ELISA檢測結果表明，用10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后均可檢測到KHV的抗體，用pET32a-ORF136 表達的蛋白20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗體水平比10 μg/尾劑量蛋白免疫后的抗體水平高且差異不顯著（P＞0.05），且維持的時間也較長；而用pET32a-ORF126 表達的蛋白10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗體水平差異不顯著（P＞0.05）。

為研制預防錦鯉皰疹病毒的疫苗以及可能應用于檢測本病的待選目標蛋白，本研究選擇錦鯉皰疹病毒（KHV）ORF126 基因作為研究對象并用ELISA檢測免疫表達的蛋白后不同時間的抗體水平確定其免疫效果，為疫苗的研究探索一條新路。

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