一種用于快速檢測奶牛乳房炎病原菌的鑒別培養基組合平板

孫虎芝，盧國民，任慧英

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島266109）

奶牛乳房炎是一種奶牛的多發病和常見病，是由多種致病微生物引起的局部病變，在奶牛養殖業中造成巨大經濟損失。因此，加強對奶牛乳房炎的預防、診斷和治療顯得尤為重要。據報道，引起奶牛乳房炎的致病微生物共有100多種，分為接觸類傳染病原菌和環境病原菌兩大類[1]。接觸類病原菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌等；環境病原菌主要為大腸桿菌、酵母，以及皰疹病毒和口蹄疫病毒等[2]。細菌性病原常見金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌；化膿隱秘桿菌是一種小的，多形態的革蘭陽性的條件致病桿菌[3]，可引起夏季牧場干奶期奶牛的“夏季乳房炎”，而且會在蠅的協助下發生“牛-牛傳播”。此外，克雷伯氏菌菌屬、產氣桿菌屬、大腸埃希菌屬等細菌也可以引起發病。針對奶牛乳房炎的致病菌如何快速診斷尤為重要，這對及時治療奶牛乳房炎起著關鍵作用。

由于奶牛乳房炎病原繁多，不同的微生物需要不同診斷方法，因此診斷方法多種多樣。采用傳統的細菌鑒定方法需要進行細菌的分離培養、形態檢查及生化鑒定，鑒定程序繁瑣且耗時長。PCR診斷技術快速，但是由于奶牛乳房炎的病原種類多，無法根據臨床癥狀判斷疑似病原，針對單一病原的PCR診斷方法存在很大的盲目性。

瑞典國家獸醫研究所研制的鑒別培養基組合平板SELMA及SELMAPLUS，可用于臨床奶牛乳房炎的快速診斷，并可對金黃色葡萄球菌進行耐藥性檢測。本文對SELMA系列平板進行介紹。

1 SELMA系列平板

SELMA平板有3個不同的檢測區域，SELMA PLUS平板有4個不同的檢測區域。每個區域含有不同的鑒別培養基，極大地方便了細菌性奶牛乳房炎的安全快速診斷。相應區域的平板背面進行了數字標記。在SELMA平板上，“1”為牛血液瓊脂，含有七葉苷，所有的需氧性細菌可在此生長；“2”為麥康凱培養基，只有革蘭陰性菌方可生長；“3”為甘露醇鹽瓊脂，葡萄球菌屬及腸球菌屬的細菌可在此生長。在上面生長的黃色菌落還可以用于檢測葡萄球菌是否產生青霉素酶。在SELMA PLUS平板上，“1”及“2”同SELMA平板，“3”為PGUA瓊脂（PGUA為4-硝基苯吡喃葡萄糖苷，為β-D-葡萄糖苷酶的底物），用于鑒定大腸桿菌，“4”為甘露醇鹽瓊脂，同SLEMA平板上的“3”。

2 SELMA系列平板適用的病料

SELMA和SELMA PLUS選擇性培養基的成品均達到產品質量檢測和產品品質保證的標準，用于奶牛乳房炎病原的培養及分類。大多數情況下，臨床上急性的奶牛乳房炎由單一的細菌菌株引起，分離培養得到的菌落性狀一致。從亞臨床感染的奶牛乳房炎、黏膜、皮膚和傷口等處的樣本往往可同時分離到多種細菌，這種情況下，SELMA系列的平板顯然不適合進行細菌的培養和分類，因為SEMLA系列的平板上每種培養基僅占平板的1/3或1/4，這么小的區域很難區分單個菌落，而單個菌落的特征是鑒定細菌的重要依據，因此對于非牛奶樣本，推薦使用單獨的牛血液瓊脂平板進行分離培養。

3 SELMA系列平板的使用方法

3.1 分離培養 SELMA系列平板的蓋子內側容易凝結冷凝水，使用前應輕輕打開平板。輕輕晃動裝奶樣的試管，用10μL取菌環取樣后在每個區域上分別進行劃線分離，按照數字的順序接種，首先在牛血液瓊脂上進行。為便于正確診斷，每個平板只接種一個奶樣。接種后應盡快將平板進行37℃倒置培養18～48 h。培養18～24 h之后進行第一次觀察，如果沒有細菌生長，應繼續培養24 h，以檢查是否存在緩慢生長的細菌。

3.2 生長觀察 檢查平板上細菌的生長狀況時，在反射光下可觀察到細小的菌落，用半透明的光線可觀察細菌的溶血性。如果牛血液瓊脂上沒有細菌生長或者有少量生長，說明奶樣中細菌量極少，沒有必要進行進一步的細菌學檢測。

3.3 不同細菌的鑒別 所有的有氧細菌能夠在牛血液瓊脂上生長。鏈球菌只在牛血液瓊脂上生長。葡萄球菌和腸球菌在牛血液瓊脂和甘露醇鹽瓊脂上生長。革蘭陰性菌在牛血液瓊脂、麥康凱培養基和PGUA瓊脂上生長。甘露醇鹽瓊脂用于區別金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌；麥康凱培養基用于鑒別革蘭陰性菌；PGUA瓊脂用于區分大腸桿菌和克雷伯氏菌屬的細菌。

3.3.1 革蘭陽性菌 （1）葡萄球菌屬：葡萄球菌屬的細菌可分為金黃色葡萄球菌（為凝固酶陽性）和凝固酶陰性葡萄球菌，均可在牛血液瓊脂和甘露醇鹽瓊脂上生長。金黃色葡萄球菌的典型特點是在牛血液瓊脂上形成雙層溶血環，而凝固酶陰性葡萄球菌沒有此現象。圍繞金黃色葡萄球菌菌落內層的溶血環透明，外層溶血環不透明。在甘露醇鹽瓊脂上，金黃色葡萄球菌因為能利用甘露醇，故其菌落周圍的培養基變成黃色，而凝固酶陰性葡萄球菌菌落周圍通常沒有這種顏色變化。葡萄球菌屬的細菌易產生青霉素酶導致出現耐藥性。青霉素酶又稱β-內酰胺酶，可水解β-內酰胺類抗生素，包括青霉素G；氨基青霉素類，如氨芐西林、阿莫西林、匹氨西林；羧基青霉素類，如羧芐西林、替卡西林等；及脲基青霉素類，如呋芐西林、美洛西林等。因此，在SELMA系列平板上分離到葡萄球菌的基礎上，進行青霉素酶試驗可直接評價細菌的耐藥性，為臨床治療奶牛乳房炎提供依據。金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌均應進行青霉素酶產生試驗，方法如下。

當觀察到甘露醇鹽瓊脂上菌落周圍的瓊脂變黃后，將頭孢噻吩藥敏紙片貼放于黃色的菌落上。將平板置37℃孵育15～20min，如果紙片顏色由粉紅色變為深紅色則說明該菌株產生青霉素酶。藥敏紙片顏色觀察最好從平板背面進行。有的時候，紙片的顏色變化不完整，只有菌落貼到紙片上的位置才會出現小紅點。需要注意的是，青霉素酶試驗只能在僅含有一種菌落的情況下采用。該試驗不能在牛血液瓊脂上進行，也不能在葡萄球菌屬以外的細菌菌落上進行，因為其他菌屬的細菌也會使甘露醇鹽瓊脂變黃。

如果甘露醇鹽瓊脂上的菌落沒有變黃，即為凝固酶陰性葡萄球菌，那么青霉素酶的產生試驗需要在載玻片上做。將頭孢噻吩藥敏紙片放于載玻片上，用微量的無菌蒸餾水或生理鹽水濕潤，然后用接種環從牛血液瓊脂上挑取菌落涂抹到藥敏紙片上，放在37℃的環境下孵育，在15～30min內觀察紙片的顏色變化，紙片從粉紅色變為深紅色說明細菌產生青霉素酶，重要的是孵育的全過程需要在濕潤的條件下進行，因此通常將其放在空的培養皿里。

（2）鏈球菌屬：大多數情況下，所有的鏈球菌都能夠在18～24 h內在牛血液瓊脂上形成可見菌落。β-溶血性鏈球菌，例如無乳鏈球菌，常在菌落周圍形成透明的溶血環[5]。α-溶血性鏈球菌，例如停乳鏈球菌，在菌落周圍形成草綠色的溶血環。乳房鏈球菌也可以形成草綠色溶血環，故不能與其他鏈球菌區分開來。腸球菌有時可以在甘露醇鹽瓊脂上形成小的菌落并且使培養基變黃。但是，鏈球菌的菌落普遍比較細小，從形態上容易與腸球菌區別。

（3）化膿隱秘桿菌：化膿隱秘桿菌經過18～24 h的培養，在反射光下勉強可見針尖大小的菌落。在半透明條件下可能會觀察到微弱的不透明溶血環。繼續培養24 h后，菌落更易于觀察，小的溶血環更加清晰。

3.3.2 革蘭陰性菌 大腸菌群在培養4～6 h后就可在牛血液瓊脂和麥康凱培養基形成小菌落。只有大腸桿菌和克雷伯氏菌屬的細菌會在麥康凱培養基上形成紫紅色的菌落。溶血性大腸桿菌在牛血液瓊脂上產生透明的溶血環。克雷伯氏菌屬的細菌比大腸桿菌的菌落更黏稠，當用接種環挑取菌落時，常產生菌落的拉絲現象。

大腸桿菌和克雷伯氏菌屬的細菌在SELMA PLUS平板上很容易區分。大腸桿菌在PGUA瓊脂上會使菌落周圍的瓊脂變成黃綠色。當PGUA瓊脂上有大量的大腸桿菌生長時，整個PGUA瓊脂都變為黃綠色，少量大腸桿菌生長時，只有菌落周圍才變色。在PGUA瓊脂上生長的克雷伯氏菌屬的細菌則不會引起培養基的顏色變化。

假單胞菌屬在牛血液瓊脂、麥康凱培養基和PGUA瓊脂上可形成具有典型焦糖味的灰綠色發光的菌落，這一點與其他細菌相比具有典型的鑒別意義。奇異變形桿菌常在牛血液瓊脂上進行彌漫生長，而在其他的區域上則可見單個菌落，且不引起培養基顏色變化。

3.3.3 其他細菌 除上述的細菌外，尚有多種細菌可引起奶牛乳房炎，例如芽孢桿菌屬和腸桿菌科的某些菌種。芽孢桿菌的菌落相對較大而且邊緣不整齊，通常具有溶血作用，有時可能會在甘露醇鹽瓊脂上生長。酵母通常在牛血液瓊脂上生長，但有時經過48 h培養之后也會在甘露醇鹽瓊脂上生長。牛棒狀桿菌通常被認為是不致病的，常從乳房炎樣本中分離到。經過48 h培養后會在牛血液瓊脂上形成不溶血、干燥的白色菌落。

各種奶牛乳房炎病原的鑒別見表1。

表1 各種奶牛乳房炎病原的鑒別

4 其他說明

SELMA系列平板由瑞典國家獸醫研究所研制。SELMA和SELMA PLUS平板倒置冷藏的保存期為2個月。青霉素酶試驗所用的頭孢噻吩紙片的保存期為1年。如果無法通過SELMA系列平板判定檢測結果，應將平板或牛奶樣本送往獸醫細菌學實驗室進行進一步的檢測。對分離到的細菌進行藥敏試驗，可有效指導臨床用藥。SELMA系列平板方便了奶牛乳房炎的快速、便捷的準確診斷。

[1]甘露.奶牛乳房炎病原菌PCR快速鑒定及牛源地衣芽孢桿菌感染小鼠乳房炎模型的研究[D].蕪湖：安徽師范大學，2012.

[2]劇慧棟.奶牛乳房炎主要致病菌的相關研究[D].石家莊：河北師范大學，2012.

[3]趙敬翠，李杰，劉耀川，等.化膿隱秘桿菌的特性及化膿隱秘桿菌病的防治[J].黑龍江畜牧獸醫，2009，11：92-93.

[4]陳海兒，陳群英，張慧萍.無乳鏈球菌213株標本分布及耐藥性分析[J].中國藥物與臨床，2013，02：252-254.

[5]Bengt Ekberg.SELMA，SELMA PLUS[EB/OL].http：//www.sva.se/en/Service-and-products/Substrate production/SELMA-and-SELMA-PLUS，2011-09-15/2013-11-22.