幾種中藥單體促進阿霉素內(nèi)化協(xié)同誘導(dǎo)白血病細胞凋亡

王長文，張秀榮，李 妍

（1.吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林吉林132013；3.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 吉林132013）

阿霉素(Adriamycin,ADR)臨床上用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌和肝癌等腫瘤的治療,是目前最常用的抗腫瘤藥物之一。除具有骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等毒性外,長期應(yīng)用ADR還導(dǎo)致劑量依賴性心臟毒性效應(yīng),使其臨床應(yīng)用受限［1］?；熕幬锱c中藥合理搭配可實現(xiàn)減毒增效、扶正怯邪和增強機體免疫力效應(yīng)。近年來，篩選中藥組方或單體成分，與化療藥物組合而建立減毒化療方案研究受到重視。ADR屬蒽環(huán)類抗腫瘤藥，是P-gp等耐藥分子的底物，被P-gp轉(zhuǎn)運到細胞外，從而導(dǎo)致耐藥［2］。ADR具有劑量依賴的心臟毒性，而通過促進ADR內(nèi)化可減少ADR在非耐藥的腫瘤治療時藥物的用量，減少其心臟毒性副作用的發(fā)生。本試驗在已建立細胞內(nèi)ADR含量檢測方法的基礎(chǔ)上，篩選可促進ADR內(nèi)化，增強ADR抗腫瘤效應(yīng)的中藥單體。

1 材料與方法

1.1 材料 白血病細胞株HL60，購自美國典型生物收藏中心(Am erican type culture co llection，ATCC)；RPM I-1640培養(yǎng)液，購自GIBICO公司；小牛血清，購自黃巖四季青生物試劑有限公司。阿霉素（Adriamycin，ADR）為Farmitalia Carlo Eeba公司產(chǎn)品。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)，購自大連市醫(yī)藥科學研究所；β-欖香烯(β-elemene)，購自大連金港制藥廠；姜黃素（curcumin），購自國家標準物質(zhì)中心；WST-1細胞增殖檢測試，劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。Annexin-V和PI雙染凋亡檢測試劑盒，購自eBioscinedce公司(美國)；活化Cas?pase-3抗體、β-actin抗體、HRP標記的羊抗鼠、羊抗兔二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物干預(yù) HL60為懸浮生長細胞，采用含10%小牛血清1 640培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng)。將細胞用培養(yǎng)液調(diào)為3×105/mL，按3mL/孔接種于6孔板。加入不同濃度ADR(0、2.5、5和10μmol/L）和NCTD（0和7.5μmol/L），作用4 h后收集細胞，采用流式細胞術(shù)分析細胞內(nèi)ADR的相對含量。為分析ADR和NCTD聯(lián)合后，是否可協(xié)同抗腫瘤，取ADR和NCTD處理16 h后的細胞，分析細胞凋亡和活化Caspase-3表達。細胞接種于96孔板，加入不同濃度ADR(0、2.5、5μmol/L和10μmol/L）和NCTD（0和7.5μmol/L），處理72 h后，分析細胞增殖抑制率（in?hibition rate，IR）。采用不同濃度ADR和β-欖香烯（10 μmol/L）或姜黃素（15μmol/L）處理HL60細胞，相同的方法分析細胞內(nèi)ADR相對含量、細胞凋亡、活化Caspase-3表達和IR。

1.3細胞內(nèi)ADR的相對含量分析 本研究利用ADR發(fā)射的紅色熒光，分析細胞ADR的相對含量［3］。

1.4 細胞凋亡 將細胞用PBS洗滌2次，用結(jié)合緩沖液調(diào)為2×106/mL的細胞懸液。取190μL細胞懸液，加入10μL FITC-標記Annexin-V，室溫下避光反應(yīng)15min；離心棄上清，加入結(jié)合緩沖液500μL，再次洗滌后，475μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，接入PI溶液25μL，混勻后立即用流式細胞儀分析。

1.5 活化Caspase-3表達 收集細胞，參照文獻[4]方法提取細胞總蛋白，變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)印電泳將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜［4］。室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉膜小2 h，將膜與稀釋的一抗（β-actin和活化Caspase-3抗體）在4℃條件下反應(yīng)過夜。次日，室溫下用0.5%Twee-20/TBS洗3次后，加入二抗并孵育2 h，再用0.5%Tween-20的TBS洗膜3次，ECL化學發(fā)光試劑盒檢測特異條帶。

1.6 細胞增殖抑制率分析 藥物處理細胞72 h，在空白對照組內(nèi)按每孔10μL加入PB溶液，試驗組加入10μL的WST-1，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)檢測儀檢測450 nm的吸光度值(A450)。按下列公式計算IR,并以3次獨立生物學試驗的平均值表示最終試驗結(jié)果。

IR=[1-(A 450T-A 450B)/(A 450C-A 450B)]×100%

2結(jié)果

2.1 3種中藥單體對白血病細胞內(nèi)化阿霉素的影響 ADR(0、2.5、5μmol/L和10μmol/L）和NCTD（0和7.5μmol/L）處理4 h后，細胞內(nèi)紅色熒光強度代表ADR的相對含量（圖1）。3種中藥單體對細胞內(nèi)化ADR的影響見表1。結(jié)果顯示，3種中藥單體中，NCTD和姜黃素可促進白血病細胞內(nèi)化ADR。

2.2 中藥單體和阿霉素對白血病細胞凋亡的影響

ADR(0、2.5、5μmol/L和10μmol/L）和NCTD（0和7.5μmol/L）處理16 h，流式細胞術(shù)分析細胞凋亡，圖中1、2和3象限內(nèi)細胞分別代表壞死細胞、晚期凋亡細胞、早期凋亡細胞和活細胞（圖2）。將象限2和3內(nèi)細胞的百分率合計為凋亡細胞，則3種中藥單體對HL60細胞凋亡的影響見表2。ADR單獨作用組比較，3種中藥單體均可增強ADR誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。

圖1 ADR和NCTD對白血病細胞內(nèi)化ADR的影響

表1 3種中藥單體對白血病細胞內(nèi)化ADR的影響

表2 3種中藥單體對白血病細胞凋亡的影響（凋亡細胞百分率%）

圖2 ADR和NCTD對白血病細胞凋亡的影響

2.3 中藥單體和阿霉素對白血病細胞增殖的影響

ADR(0、2.5、μmol/L5和10μmol/L）與NCTD(7.5 μmol/L)、β-欖香烯（10μmol/L）或姜黃素（15μmol/L）處理HL60細胞72 h，對細胞增殖的抑制率見表3.與ADR單獨作用組比較，3種中藥單體均可增強ADR對白血病細胞的抑制作用，其中NCTD和姜黃素的增敏作用較強。

表3 3種中藥單體對ADR抑制白血病細胞增殖的影響 （IR%）

2.4 中藥單體和阿霉素對白血病細胞活化Cas?pase-3的影響 ADR(0和2.5μmol/L)與NCTD(7.5 μmol/L)、β-欖香烯（10μmol/L）或姜黃素（15μmol/L）處理HL60細胞16 h，活化Caspase-3的表見圖3。與ADR單獨作用比較，NCTD和姜黃素與ADR聯(lián)合對活化Caspase-3的表達有增強作用。

圖3 中藥單體和阿霉素對白血病細胞Caspase-3表達的影響

3 討論

ADR屬于蒽環(huán)類抗生素，是一種高效的廣譜抗抗生素,是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物。心臟毒性是ADR臨床應(yīng)用的主要不良反應(yīng)之一,表現(xiàn)為劑量依賴的不可逆轉(zhuǎn)的心肌病、充血性心力衰竭等，限制了其臨床應(yīng)用［3-4］。ADR的心臟毒性機制尚未完全清楚,可能與自由基增加、線粒體損傷、鈣超載和細胞凋亡等多因素共同參與關(guān)系密切。其中，依濃度增加而自由基水平和線粒體損傷，進而導(dǎo)致心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡是毒性產(chǎn)生的早起事件和關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4-5］。ADR與心肌組織的親和力高于其他組織,進入心肌細胞后,在代謝過程中產(chǎn)生的自由基引起線粒體膜和內(nèi)脂網(wǎng)的脂質(zhì)過氧化。防護ADR毒性的策略包括建立聯(lián)合方案降低其用量、抗氧化制劑和自由基清除、抑制細胞凋亡和鈣離子穩(wěn)定劑等。回顧性研究表明,當ADR積累量達550mg/m2時,充血性心力衰竭的發(fā)生率＞26%，降低ADR的用量對降低毒性作用具有重要意義［5］。

ADR的分子量543.52，屬于大環(huán)內(nèi)酯類藥物，若腫瘤原發(fā)為P-gp高表達，或化療藥物誘導(dǎo)其表達增加，則加速阿霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物被“藥泵”運出細胞的效率，導(dǎo)致藥物內(nèi)化入細胞的ADR量減少。近年來，有學者提出，自中藥有效成分中篩選促進藥物內(nèi)化入細胞的制劑，與ADR聯(lián)合以減少ADR用量，達到降低毒性作用的目標［6］。本研究采用流式細胞術(shù)分析細胞內(nèi)ADR的相對含量，分析3種中藥單體（去甲斑蝥素、β-欖香烯和姜黃素與ADR聯(lián)合作用后，白血病細胞內(nèi)ADR含量的變化。結(jié)果表明，去甲斑蝥素和姜黃素可通過促進ADR內(nèi)化。進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩者還可促ADR誘導(dǎo)活化Caspase-3表達、細胞凋亡；聯(lián)合后對癌細胞增殖的效應(yīng)也增強。研究結(jié)果提示，去甲斑蝥素或姜黃素與ADR聯(lián)合，可獲得相同的抗腫瘤效應(yīng)，但減少ADR的用量。我國中藥資源豐富，從中選擇可降低化療藥物毒副作用的制劑，具有重要意義。惡性腫瘤的治療常需要在殺傷癌細胞的同時，盡量減少毒副作用，保持機體的免疫力。去甲斑蝥素和姜黃素單獨應(yīng)用具有一定的抗腫瘤作用，而毒副作用?。?-8］。

本研究結(jié)果表明，NCTD和姜黃素與ADR聯(lián)合，具有減少ADR劑量的潛在價值。但在體內(nèi)環(huán)境下，NCTD和姜黃素是否還可通過該機制與ADR協(xié)同抗腫瘤還需要進一步研究。

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