多拉菌素澆潑劑對小鼠免疫功能影響的試驗

高玉紅，宋銘忻

（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030；2.黑龍江職業學院，黑龍江 哈爾濱150080）

1993年，美國輝瑞（Pfizer）公司研發人員利用突變的阿維鏈霉菌研制合成了更新一代的優秀的大環內酯類抗寄生蟲藥物-多拉菌素（Doramectin）[1]。這種新研制的多拉菌素是阿維菌素的第二代產品，其合成的機理是在阿維菌素的第25位C上引入一環己烷基而形成的[2]，多拉菌素與阿維菌素相比其優越性在于消除率低，血藥濃度維持時間較長，生物半衰期比較長，生物利用率比阿維菌素更高[1-3]。

多拉菌素被認為是目前阿維菌素族中最優秀的內外兼殺抗寄生蟲藥物之一，對體內外線蟲以及體外的節肢動物均有良好的驅殺作用[4]。有研究結果表明，5mg/kg體重對小鼠的消化道線蟲具有良好的驅殺效果[5]。

以往多拉菌素的劑型多以注射劑為主，但是由于藥物的自身特點，如水溶性不佳，在多拉菌素注射劑的生產過程中會添加助溶劑等刺激性比較強的有機溶劑，在臨床應用過程中會對動物造成一定程度的刺激性[6]，且費時費力，使飼養成本相對增加。基于此種原因，東北農業大學動物醫學學院寄生蟲教研室自行開發研制出了更加便于應用的多拉菌素的新劑型-多拉菌素澆潑劑。此種劑型具有操作更加簡易、療效十分確切、對動物機體的刺激性非常小等優點。延長藥物對寄生蟲的作用時間和增強藥物的療效[7]。前期研究結果表明，多拉菌素澆潑劑對家兔無任何毒性反應，對豚鼠皮膚無刺激性反應，不產生致敏作用[8]。對小鼠無致畸性，無遺傳毒性作用[9]。為了進一步檢測多拉菌素澆潑劑應用的安全性，進行了免疫學方面的相關試驗。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 清潔級健康昆明系小鼠175只，雌雄各半，體重18～22 g，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1.2 試驗試劑與儀器

主要試劑：多拉菌素澆潑劑，由東北農業大學動物醫學學院寄生蟲教研室自行研制；FITC Rat Anti-Mouse CD4，Bioledend公 司；PE Rat Anti-Mouse CD8a，Bioledend公司；環磷酰胺（Cyclophos?phamide，Cy）New Jersey USA：1-800-ACROS-01；免疫球蛋白IgG、IgM、IgA試劑盒，購自三維公司。

主要儀器：FACSAria流式細胞儀（美國BD公司）BD FACSDiva Software；全自動生化分析儀（D240V）天津神州英諾華醫療科技有限公司；大容量低溫高速離心機HITACHIRXⅡSeries。

2 試驗方法

將175只小鼠隨機分成5組：對照組（C組）：該組不用藥，每只小鼠皮膚澆潑等體積的溶劑；環磷酰胺組（Cy組）：劑量80mg/kg體重，按0.02mL/g腹腔注射4 mg/mL生理鹽水Cy溶液；低劑量組（L組）：該組每只小鼠經皮給藥多拉菌素澆潑劑5 mg/kg體重；中劑量組（M組）：該組每只小鼠經皮給藥多拉菌素澆潑劑15mg/kg體重；高劑量組（H組）：該組每只小鼠經皮給藥多拉菌素澆潑劑30 mg/kg體重。C組、CY組、L組、M組、H組各組于給藥后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d分別每組取5只小鼠，每只取血液200μL用于檢測小鼠血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比例變化，200μL常規方法分離血清，用于檢測血清中的抗體IgG、IgM、IgA的變化。

2.1 流式細胞儀檢測小鼠外周血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的變化 取200μL小鼠血液于肝素抗凝管中，每個樣各取抗凝血100μL于2mLEP管中，并且再分別取100μL加入一個EP管中混勻，從混合血液中取100μL分別加入3個EP管中，作為陰性、CD4+單染、CD8+單染；加入CD4+、CD8+抗體，使血液中CD4+抗體終濃度1∶200，CD8+抗體終濃度1∶100。陰性對照不加抗體，CD4+單染只加CD4+抗體，CD8+單染只加CD8+抗體；把各管避光放入4℃、15min使相應的淋巴細胞與抗體結合；取出后每管各加入0.5mL溶血素，避光放入30℃水浴中，30min；取出各管加入PBS1～1.5mL，850 r/min（4℃）離心10min，棄上清，每管加0.5mL 1%甲醛PBS重懸，加完輕輕吹打3～4次，避光置于冰塊中待流式細胞儀檢測。整個過程應盡量避免劇烈操作，以免造成對細胞的損傷。

2.2 全自動生化分析儀檢測血清中IgG、IgA、IgM的變化 全自動生化分析儀檢測血清中的抗體IgG、IgM、IgA的變化。參數設定參照試劑說明書進行。

3 結果分析與評價

3.1 多拉菌素澆潑劑對小鼠外周血CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的影響 C組、Cy組、L組、M組、H組于給藥后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d分別取小鼠外周血液，將淋巴細胞經特異性單克隆熒光抗體標記后，在流式細胞儀上能夠根據細胞大小獲得區域明顯的淋巴細胞團。經BDFACSDiva Software分析處理，并采用二維點陣圖形式表示。結果見圖1～3。

圖1 多拉菌素澆潑劑對小鼠血液CD4+百分數的影響

圖2 多拉菌素澆潑劑對小鼠血液CD8+百分數的影響

流式細胞儀檢測外周血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的變化，檢測結果如1～3圖所示：

Cy組CD4+細胞百分數極顯著低于C組（P＜0.01），L組和和M組CD4+百分數在第14到21日顯著高于C組（P＜0.05），其他時間點雖然高于C組，但未見統計學差異（P＞0.05）。L組和M組之間CD4+百分數未見統計學差異。H組CD4+百分數低于C組，但未見統計學差異（P＞0.05）。Cy組CD8+細胞百分數顯著低于C組（P＜0.05），L組、M組、H組的CD8+淋巴細胞百分數和C組比較均未見顯著性差異（P＞0.05）。Cy組在各個時間點CD4+/CD8+均低于C組，L組和M組CD4+/CD8+高于C組，H組CD4+/CD8+低于C組。

圖3 多拉菌素澆潑劑對小鼠血液CD4+/CD8+的影響

3.2 多拉菌素澆潑劑對小鼠血清中IgA、IgG、IgM的影響 常規方法分離血清，全自動生化分析儀檢測血清中的抗體IgG、IgM、IgA的變化。參數設定參照試劑說明書進行，結果如圖4～6所示。

圖4 多拉菌素澆潑劑對小鼠血清I gG的影響

圖5 多拉菌素澆潑劑對小鼠血清I gM的影響

小鼠血清中的IgG含量在各個時間點Cy組均極顯著低于C組（P＜0.01），L組、M組與C之間差異不顯著（P＞0.05），H組低于C組，但未見統計學差異（P＞0.05）。IgM、IgA與IgG檢測結果相同。

4 討論

圖6 多拉菌素澆潑劑對小鼠血清I gA的影響

T細胞按其表面表達CD分子的不同，分為CD4+T細胞和CD8+T細胞兩大亞群，所有T細胞表型均為CD3+T細胞[10]。通常情況下，正常機體內CD4+T細胞數量高于CD8+T細胞的數量，二者的比值一般保持較為穩定的平衡狀態。李鋒等認為正常小鼠的CD4+/CD8+的比值大約為1.6，這與本試驗測得正常小鼠的CD4+/CD8+的比值較為接近。由于機體在受到多種環境因素刺激時，外周血T細胞亞群也會發生相應的變化，從而使機體的免疫功能發生變化。CD4+/CD8+的比值上升，通常提示機體的免疫功能有所升高[11]。

本試驗研究結果發現，Cy組CD4+細胞百分數極顯著低于C組（P＜0.01），由環磷酰胺所導致的免疫抑制小鼠外周血中CD4+/CD8+的比值明顯下降，結果證實，環磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能，免疫抑制小鼠模型建造成功。L組和M組CD4+百分數在第14和21日顯著高于C組（P＜0.05），其他時間點雖然高于C組，但未見統計學差異（P＞0.05）。L組和M組之間CD4+百分數未見統計學差異。H組CD4+百分數低于C組，但未見統計學差異（P＞0.05）。CD8+淋巴細胞百分比的變化：Cy組和C組差異顯著（P＜0.05），其他各組的CD8+淋巴細胞百分數和C組相比均未見顯著性差異（P＞0.05）。可以認為，多拉菌素澆潑劑對機體特異性細胞免疫功能的改善作用，主要是通過調節血液中輔助性CD4+T細胞的數量和CD4+/CD8+細胞的比值來實現對小鼠特異性細胞免疫功能的調節作用。具體機理有待于進一步研究。Cy組在各個時間點CD4+/CD8+均低于C組，L組和M組CD4+/CD8+高于C組，H組CD4+/CD8+低于C組。

說明合適劑量的多拉菌素可以調節小鼠外周血液CD4+T細胞和CD4+/CD8+比值變化。此結果可以看出，合適劑量的多拉菌素澆潑劑可以朝著有利于改善小鼠免疫功能的方向發展。合適劑量多拉菌素澆潑劑作用后，小鼠特異性細胞免疫功能出現增強現象，那么多拉菌素澆潑劑引發的這種現象是通過何種機制實現的？多拉菌素澆潑劑是通過何種途徑發揮作用的？以上問題有待于進一步研究。

體液免疫是特異性免疫的重要組成部分，在抗感染免疫中與細胞免疫相輔相成，共同發揮免疫作用。B淋巴細胞是體內唯一能產生抗體免疫球蛋白分子的細胞，成熟的B淋巴細胞可分泌抗體（主要為IgG、IgM、IgA等）發揮體液免疫功能。因此，體內IgG、IgM、IgA水平可反映機體的體液免疫功能。本實驗研究結果表明，低、中、高劑量時，IgG、IgM、IgA與對照組比較無明顯差異（P＞0.05），高劑量時，IgG、IgM、IgA雖然低于對照組，但未見統計學差異（P＞0.05），說明多拉菌素澆潑劑對小鼠體液免疫功能無顯著性影響，推測多拉菌素澆潑劑對小鼠免疫功能的影響是以細胞免疫為主，其作用機制還有待于進一步研究。

5 結論

多拉菌素澆潑劑在低、中、高3個劑量組時，均可以改變外周血液CD4+、CD8+T淋巴細胞的數量，且有一定的劑量-效應關系，表明合適劑量的多拉菌素澆潑劑可以朝著有利于改善小鼠特異性細胞免疫功能的方向發展。

低、中劑量時，IgA、IgM、IgG無明顯變化，高劑量時，IgA、IgM、IgG有所降低，但和C組相比無統計學差異，說明多拉菌素澆潑劑各劑量時對小鼠體液免疫均無顯著影響。推測多拉菌素澆潑劑對小鼠免疫功能的影響是以細胞免疫為主，具體機制還有待于進一步研究。

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