豬痢疾短螺旋體熒光PCR檢測方法的建立與初步應用

張 偉，高志強，李 寧，谷 強，凌鳳俊，喬彩霞，蒲 靜，張利峰，汪 琳，吳 丹，柏亞鐸，安 健，劉 環，賴平安，張鶴曉

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 通州101113；2.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀100081；3.北京農學院，北京 昌平102206）

豬痢疾（SD）的病原體是一種革蘭陰性的厭氧性螺旋體，先后命名為是由豬痢疾密螺旋體（T.h）、豬痢疾蛇形螺旋體（S.h）。現在統一命名為豬痢疾短螺旋體（Brachyspira hyodysenteriae；B.h），目前豬痢疾密螺旋體這一名稱由于歷史的原因還被廣泛使用。該病是豬的一種腸道傳染病，以黏液性或黏液出血性腹瀉為特征[1]。在豬群中的發病率相當高，病豬生長發育受阻，耗料增加，給各地養豬業造成很大的經濟損失。據統計病豬的飼料消耗率為正常豬的2倍，而增重率僅為正常豬的1/2。根據1983年Lysons的統計，為控制豬痢疾在飼料中添加的藥物，每頭豬花費2.5～2.8美元[2]。根據Wood等（1988）的計算，豬痢疾豬群的飼料消耗，每頭上市豬要多花12.6美元，同時每頭豬還要多花費2.4美元。在美國估計每年由于豬痢疾而損失6 400萬美元[3]。

該病遍布五大洲50多個國家和地區。在我國，許多省、市都有該病的存在，并且一旦傳入豬群，若不采取嚴格的處理措施很難根除。1978年10月，上海口岸在從美國進口的451頭商品豬的檢疫中確診豬痢疾后，1979年初又在我國豬只中確診豬痢疾，并從國內豬只分離得到豬痢疾短螺旋體純培養，引起我國獸醫界的重視，并被列入《中華人民共和國進境一、二類傳染病》[4]。目前檢測中采用行業標準SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養操作規程》進行病原分離和鑒定，檢驗周期要兩周時間，并且要求嚴格的厭氧培養監控，因此急需快速、敏感、特異性強的檢測方法以替代或者補充該規程。

本研究從動物檢疫的實際出發，建立了熒光PCR檢測方法用于豬痢疾短螺旋體的快速檢測。縮短了該病原的檢測周期，并為臨床診斷提供快速、敏感、特異性強的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備

1.1.1 菌株 研究過程中應用到的菌株如表1所示。

表1 研究過程中應用到的菌株

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTP等，購自Promega公司；細菌培養基，購自北京陸橋技術有限責任公司；脫纖馬血，購自北京希凱創新科技有限公司。

1.1.3 實時熒光定量PCR儀 LightCycler 2.0，Roche公司產品；ABI7900，ABI公司。

1.1.4 厭氧培養系統 COY公司。

1.2 引物探針的設計、合成 選擇豬痢疾短螺旋體nox基因作為靶區域，設計引物和探針。引物長度為20個堿基左右，GC含量為50%～60%，引物內無二級結構和重復性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小于5℃。探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。引物、探針的名稱、序列及擴增基因見表1。引物和探針由上海旭冠生物技術有限公司合成。

1.3 熒光PCR反應體系的建立 以豬痢疾短螺旋體Brachyspira hyodysenteriae（ATCC編號：31212）的DNA作為擴增模板，對引物濃度，探針濃度，Mg2+濃度，Taq DNA聚合酶用量，循環參數等條件進行優化。

1.3.1 引物和探針濃度的優化 將篩選好的引物濃度從0.1μmol/L至0.8μmol/L以0.1μmol/L為間距遞增，探針濃度從0.025μmol/L至0.2μmol/L以0.025μmol/L遞增。對引物和探針不同濃度的配比進行了比較。

1.3.2 Mg2+濃度的優化 應用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度從1.0 mmol/L至5.0 mmol/L以0.5 mmol/L為間距遞增。對不同Mg2+濃度條件下的擴增進行了比較，其他反應物的量同表2～3。

1.3.3 Taq DNA聚合酶的用量優化 Taq酶用量（以單位U計）分別選取0.75 U、1.25 U和2.5 U三種用量。

1.3.4 循環參數優化試驗 我們針對Roche Light Cycler熒光PCR檢測儀，對循環參數的各個方面都進行了優化試驗，以期達到最佳擴增效率。在92℃/3 min的預變性之后，對該試驗中對變性溫度和時間、退火和延伸溫度及時間進行了優化試驗。我們主要比較了以下幾種循環條件的擴增效率：方法A—92℃/10 s，60℃/1min，40個循環；方法B—92℃/15 s，60℃/30 s，40個循環；方法C—94℃/10 s，60℃/1min，40個循環；方法D—92℃/5 s，55℃/5 s，60℃/30 s，40個循環；方法E—92℃/5，55℃/10，65℃/30；40個循環。

1.3.5 擴增時循環次數的確定 擴增時，采用循環次數分別為40、45和50，比較擴增結果的Ct值，進而確定擴增的循環次數。

1.4特異性試驗 提取Brachyspira hyodysenteriae（7株）和Brachyspira innocens、沙門菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌和豬鏈球菌的DNA做為模板，采用優化好的方法對提取的DNA進行熒光PCR檢測，以確定檢測方法的特異性。

1.5 敏感性和重復性試驗 選取一株B.h（ATCC編號為：31212），參照行業標準SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養操作規程》進行純培養，收集純培養的B.h，用從豬場采集的豬糞作為載體，用pH值7.4的PBS作為稀釋液進行10倍梯度稀釋，制備模擬陽性標準品，采用細胞計數板計算每個稀釋度的病原數。稀釋后，得到B.h的濃度分別為105，104，103，102，101，1.0菌/200μL。模擬樣品按照建立的熒光PCR方法進行檢測，每個樣品設置一個重復，以驗證試驗的重復性。

1.6 臨床樣品檢測 參照行業標準SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養操作規程》對從北京周邊8家豬場的351份豬糞拭子樣品進行病原分離及鑒定。采集的樣品同時按照建立的熒光PCR方法進行檢測。

2 結果

2.1 引物和探針的設計 對設計的引物和探針經BLAST驗證，表明可覆蓋所有已公布的豬痢疾短螺旋體的菌株。所合成的引物和探針見表2。

對引物探針篩選的結果為選取引物對U1 nox、L1 nox與探針PROBE nox 2的組合用于后續試驗。

表2 引物、探針的名稱、序列及擴增基因片段

2.2 熒光PCR的反應條件的優化結果 對各種反應條件進行優化發現，最適反應總體積25μL（ROCHE 2.0）或50μL（ABI7900），其中模板5.0μL（ROCHE 2.0）或10μL（ABI7900）；最適的引物濃度均為0.2μmol/L，探針濃度均為0.1μmol/L，Mg2+濃度為3mmol/L，選定1.25 U Taq酶作為使用的Taq酶量；最適循環參數為方法D。

優化后的特異性的擴增曲線見圖1，從圖1可以看出，優化后的反應體系擴增的Ct值相對較低，且升幅較高，同時具有良好的重復性。

圖1“nox組合”優化后的特異性的擴增曲線

2.3 特異性試驗 結果見圖2（a、b）。結果顯示兩種引物探針的組合針對7株從ATCC引進的B.h均出現了特征性的擴增曲線，其他幾株腸道致病菌結果均為陰性。由此證明方法有較強特異性。

圖2a nox組合特異性試驗（7株B.h）

圖2b nox組合特異性試驗

2.4 敏感性和重復性試驗 對稀釋的陽性標準樣品（105-1.0菌/200μL）進行熒光PCR檢測，結果如圖3所示（擴增曲線對應的樣品濃度從左至右依次為105-1.0菌/200μL）。結果表明，熒光PCR對系列梯度稀釋的陽性標準品進行檢測，在B.h濃度為101菌/200μL時，有較弱的擴增曲線，1.0菌/200μL濃度時無特異性擴增曲線。故PCR對豬痢疾短螺旋體模擬樣品最低可檢測至B.h濃度101菌/200μL。

圖3 敏感性和重復性試驗

2.5 臨床樣品的檢測 對北京周邊8個豬場采集的351份豬糞拭子進行檢測。結果如表3所示，與傳統分離培養鑒定的符合率為100%。該方法的可以在4 h內完成檢測，大大縮短了檢驗周期，與傳統的病原分離培養結果完全一致，證明該方法是一種快速、準確、特異性強的的檢測方法。

表3 臨床樣品檢測

3 結論與討論

豬痢疾在豬群中的發病率很高，病豬生長發育受阻，耗料增加，給各地養豬業造成很大的經濟損失。目前除了病原分離外沒有特異性好、敏感性高的檢測方法在我國廣泛使用。由于該病的病原需要嚴格的厭氧培養條件，對于該病的研究還比較少。盡管經典檢測方法仍為病原分離鑒定，但國內外越來越多的實驗室均采用核酸檢測方法進行病原檢測[1]。

本試驗選擇豬痢疾短螺旋體nox基因作為靶基因,設計引物和探針建立了豬痢疾短螺旋體熒光PCR檢測方法。用所建立的方法對以10倍梯度稀釋的豬痢疾短螺旋體培養物進行檢測，結果顯示靈敏度可達101菌/200μL；重復性試驗結果顯示所建立方法的穩定性良好；建立的兩種豬痢疾短螺旋體熒光PCR檢測方法在檢測所收集的豬痢疾短螺旋體全部為陽性，但檢測其他細菌的結果為陰性，未發現交叉反應。表明該方法敏感性高、特異性強。

用該方法對8個豬場采集的351份豬糞拭子進行檢測。熒光PCR檢測方法與分離培養鑒定法的符合率為100%，并且檢驗周期為小于4 h，進一步驗證了所建立的方法具有快速、靈敏、準確、特異性強的特點。

傳統的分離培養及鑒定的方法檢驗周期長，一般需要10 d左右的時間，并且由于豬痢疾短螺旋體是一種厭氧菌，分離培養需要嚴格的厭氧環境，對實驗室的要求也非常苛刻，操作復雜。大量的試驗數據表明，本試驗所建立的兩種熒光PCR檢測方法與傳統的病原分離培養鑒定法（金標）在敏感性和特異性上無顯著差別。但與分離培養鑒定法相比其快速的特點就非常突出。可以大大縮短檢驗周期，同時可以有效地避免由于樣品采集、運輸過程中造成病原分離失敗的假陰性結果。

隨著熒光PCR技術被廣泛認可。本試驗所建立的熒光PCR檢測方法可以在進出境檢測以及日常的臨床疫病監控和診斷中發揮更加積極地作用。

[1]David J，Hampson C，Fellstrom Jill Thomson.Swine Dysentery Diseasesof Swine 9th edit：895.

[2]Lysons R J，Lemcke R M.Swine dysentery：to isolate or to fluo?resce[J].Vet Rec.1983，112(9)：203.

[3]Wood E N，Lysons R J.Financial benefit from the eradication of swine dysentery[J].VetRec.1988，122(12)：277-279.

[4] 覃青松，金梅林，劉建杰，等.豬痢疾短螺旋體綜述[J].2002，297：306-310.