GDNF 及dbcAMP 對神經干細胞誘導分化為多巴胺能神經元作用的實驗研究

陳 立，杜 娟，陳 麗，呂曉紅

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是中老年人常見的神經系統變性疾病，主要病理變化是路易小體形成和黑質多巴胺能神經元丟失，目前的治療只能通過多巴胺替代療法改善其癥狀，并不能阻止病情的進展。神經干細胞的全能性和成體干細胞橫向分化的多潛能性為帕金森的治療提供了新的思路和方法。本實驗利用神經營養因子GDNF 及dbcAMP 對神經干細胞進行單獨及聯合誘導，希望能獲得足夠數量的多巴胺能神經元，為定向誘導分化的神經元進一步應用于臨床打下基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級孕14～16 d Wistar 大鼠由吉林大學動物中心提供。

1.2 試劑 培養基DMEM/F12、B27(Gibco)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)和膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)(Peprotech)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)，二丁酰環磷腺苷酸(dibutyryl adenosine 3’，5’cyclic monophosphate，dbcAMP)(Santa)，兔抗鼠神經元特異性中間絲(Neuron-specific intermediate filament，Nestin)、兔抗鼠5-溴脫氧尿苷(5-Bromodeoxyuridine，Brdu)、兔抗鼠絡氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體、山羊抗兔免疫組化試劑盒、異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.3 神經干細胞的體外分離及原代培養 神經干細胞的體外分離與培養 取妊娠14～16 d 的Wistar 大鼠，給予乙醚吸入麻醉，無菌操作取出胚胎，置于冰浴的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)內，分離胚胎中的腦組織，小心剝離腦膜及血管，將取出的腦組織剪成小組織塊，加入0.125% 胰蛋白酶消化30 min 左右，用含10% 胎牛血清終止消化，0.01%DNaseI 繼續對腦組織消化30 min 左右，離心，將離心后的細胞懸浮于干細胞培養基中，培養基包含bFGF 20 ng/ml 和EGF 20 ng/ml 及DMEM/F12 培養基(另含2% B27，HEPES 10 mmol/L，谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100 U/ml)，調整細胞密度至5×105/ml，接種至25 ml 培養瓶。在37℃飽和濕度、5% CO2/95%空氣的二氧化碳培養箱中培養。每2～3 d 半量換液1 次，7 d 傳代1 次。

1.4 神經干細胞的鑒定 待培養至1 w 左右時取細胞懸液1 瓶，細胞離心(1000 r/min，5 min)后棄上清，重懸，吸管吹打分離細胞克隆，注意力度要適當均勻，重新細胞計數后以5×104/ml 接種于裝有細胞爬片的24 孔板內，進行Nestin 及Brdu 鑒定。

1.5 NSC 的誘導分化 取第2 代的NSC 以1×105/ml 的密度接種于置有預先經多聚賴氨酸包被蓋玻片的24 孔培養板。分別加入以下培養液:A組(對照組)DMEM/F12+10% FBS+2% B27，B組加入20 ng/ml GDNF，C 組加入200 μmol/L dbcAMP，D 組加入200 μmol/L dbcAMP+20 ng/ml GDNF。每組3 孔，以后每3 d 半量換液1 次，分化7 d 后終止誘導。

1.6 免疫細胞化學染色 取出終止誘導的細胞爬片，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% TritonX-100 中室溫下孵育標本15 min，3% H2O2(0.01 mol/L PBS 配制)處理標本10 min，一抗分別為小鼠抗人Nestin 單克隆抗體，兔抗Brdu(1∶100)，兔抗TH 多克隆抗體，4 ℃濕盒過夜(一抗用PBS 稀釋)，滴加二抗37 ℃孵育標本30 min，滴加試劑SABC，20～37 ℃條件下20 min，DAB 避光顯色5～10 min，蘇木素復染，自來水返藍，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 統計學分析 免疫細胞化學染色TH 陽性的細胞代表多巴胺(Dopamine，DA)能神經元。TH 陽性細胞數/總細胞數×100%即為所得TH 陽性細胞率。所有數據經SPSS 13.0 統計軟件處理，實驗結果采用±s 表示，TH 細胞陽性率的多組樣本均數的比較用單因素方差分析。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕14～16 d Wistar 大鼠無血清培養

在無血清，神經營養因子培養條件下，24 h 可見少量細胞貼壁(見圖1)，大部分細胞懸浮生長，部分細胞分裂成3～4 個細胞團，隨著時間推移，細胞團數量逐漸增多，體積增大，大部分懸浮生長，成球形，折光性較好，無細胞突起(見圖2)，培養至1 w倒置顯微鏡觀察可見大量懸浮生長的神經球，少量神經球貼壁并有突起。

2.2 Nestin 鑒定

收集培養1 w 的神經干細胞球制作細胞爬片，行免疫細胞化學染色鑒定，結果顯示神經球呈現棕黃色，表明其具備干細胞特性(見圖3、圖4)。

2.3 Brdu 鑒定

收集細胞前24 h 給予Brdu，后制作細胞爬片，行免疫細胞化學染色，結果顯示大部分神經球呈現棕黃色，與對照組相比具有明顯差異，表明其具備干細胞增殖分化的能力(見圖5、圖6)。

2.4 神經干細胞向多巴胺能神經元分化的鑒定

2.4.1 血清分化組 通過免疫細胞化學鑒定，TH 陽性細胞數目很少，平均陽性率0.67%(見圖7)。

2.4.2 實驗組A(不同劑量組GDNF 誘導神經干細胞分化)加入GDNF10 μg/L，20 μg/L 及40 μg/L 分化1W 平均陽性率為7.1%，10.2%，10.0%。GDNF 組與血清對照組相比具有統計學意義(P＜0.05)，GDNF 在20 μg/L 濃度誘導下分化效率最高(見圖8、圖9)，GDNF 在40 μg/L 時分化率沒有明顯提高。

2.4.3 實驗組B(不同劑量組dbcAMP 誘導神經干細胞分化)加入dbcAMP100 μmol/L，200 μmol/L 及400 μmol/L 分化1W 平均陽性率為4.56%，7.99%，7.25%。dbcAMP 組與血清對照組相比具有統計學意義(P＜0.05)，dbcAMP 在200 μmol/L 濃度誘導下分化效率最高(見圖10、圖11)，dbcAMP 在200 μmol/L 及400 μmol/L 濃度設置下TH 細胞陽性率差別不大。

2.4.4 實驗 組C(GDNF20 μg/L 聯合dbcAMP200 μmol/L 誘導分化)選取GDNF 及dbcAMP 單獨誘導時TH 細胞陽性率最高時的濃度進行組合，分別加入GDNF20 μg/L，dbcAMP200 μmol/L，分化1W 后TH 細胞平均陽性率為13.36%，與單獨誘導時分化率相比可進一步提高(見圖12)，具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 GDNF 及dbcAMP 聯合誘導分化后TH 陽性細胞表達率(%，±s)

表1 GDNF 及dbcAMP 聯合誘導分化后TH 陽性細胞表達率(%，±s)

各實驗組分別與A 組比較△P＜0.05;B 組、C 組分別與D 組比較* P＜0.05

3 討論

1992 年Reynolds 和Richards 最先從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠進行自我更新的多潛能細胞群落，由此提出了神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的概念。2000 年Gage［1］將神經干細胞概括為可生成神經組織或者來源于神經系統的具有自我更新能力并且能夠通過不對稱細胞分裂產生新細胞。神經干細胞具有多向分化及自我更新的能力，其主要生物學屬性包括:(1)自我更新能力;(2)多向分化能力;(3)良好的細胞整合能力;(4)低免疫原性。

神經干細胞存在于哺乳動物神經系統的多個部位，目前已從胚胎期哺乳動物的皮質區、海馬、紋狀體、嗅球、側腦室、間腦、中腦、小腦、脊髓和視網膜中分離得到了干細胞［2，3］，成年期的哺乳動物神經干細胞主要存在于側腦室腦室下區及海馬齒狀回顆粒細胞下區［4］。

3.1 NSCs 定向分化中多巴胺能相關誘導劑應用機制的探討

目前神經干細胞培養中涉及到多種誘導機制。張文治［5］對人胚大腦神經干細胞增殖與分化的實驗研究表明，EGF 和bFGF 協同作用效果明顯優于單用，另外Svendsen［6］利用EGF 和FGF-2 體外誘導出能夠長期生存的人類中樞神經系統前體細胞，并成功移植入帕金森病大鼠模型。本實驗從孕15 d 胎鼠腦組織中提取干細胞并進行無血清培養及傳代，對于神經干細胞的鑒定主要采用應用比較廣泛的Nestin 蛋白及Brdu 蛋白進行標記。并采用EGF 和bFGF 聯合培養，濃度均為20 μg/L，培養結果顯示二者聯合應用可極大的促進神經干細胞的增殖。

B27 是一種神經細胞生長添加劑，由于含有抗氧化劑等成分，能夠減少神經細胞的損傷，被廣泛應用于中樞神經細胞的原代培養。因此本實驗中也加入了神經細胞添加因子以促進神經干細胞的增殖。GDNF 是1993 年Lin 等發現并克隆出來的，它是一種神經營養因子，是轉化生長因子家族中的一員。

GDNF 廣泛分布于中樞神經系統的的多巴胺區域，在腹側蒼白球、嗅結節、梨狀區等也有表達［7］。近年來，隨著神經干細胞的大量深入研究，GDNF 在其中的作用越來越重要，GDNF 不僅對多巴胺能神經元具有營養、支持、保護和修復作用，而且在神經干細胞分化為多巴胺能神經元中也起著重要作用。研究表明，GDNF 主要是通過其受體發揮作用的［8］。因此本實驗在細胞培養液中添加GDNF 促進干細胞的分化及維持多巴胺神經元的健康生長。

dbcAMP 是一種重要的細胞內分子，它作為第二信使，是細胞內媒介物，在細胞內它可在腺苷酸環化酶的作用下促使cAMP 合成，其誘導分化作用與其升高細胞內cAMP 程度有關。Tio 等［9］利用dbcAPM及IBMX 對間充質干細胞進行誘導，發現分化的細胞表達多巴胺能神經元早期蛋白Nurr1 及TH 蛋白;Roger 等［10］利用dbcAPM 對小鼠神經瘤細胞(Neuro-2a，N2a)進行誘導分化，發現dbcAPM 能極大的提高TH 細胞的陽性表達率，在dbcAMP 的作用下骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)及N2a 細胞均可表達DA 能神經元標記蛋白，因此本實驗利用dbcAMP 對NSCs 進行誘導分化，雖然分化比例較低，但仍有TH 陽性細胞表達，且與GDNF 聯合誘導有較高的TH 細胞表達率，目前關于dbcAMP 在NSCs 分化中的作用機制仍不十分明確。

3.2 GDNF 和dbcAMP 在NSCs 向多巴胺能神經元定向分化中的誘導效應及有效劑量的探討

Majd 等［11］研究表明在FGF2、BDNF 和GDNF 存在的培養環境下，使DA 能神經元的存活率增強了15 倍，并且促進了神經突觸的生長。而dbcAMP 促進所有神經元神經突觸的生長，但是不能增加DA能神經元的存活。實驗發現隨著誘導分化時間逐漸延長，TH 細胞陽性率逐漸降低，因此本實驗確定誘導分化的時間為1 w。具體如下:在實驗組A(GDNF組)中，我們設置了3 個不同劑量組:10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L，其中濃度為10 μg/L 時與血清誘導組相比TH 細胞陽性率顯著升高，當劑量增加到20 μg/L 時，TH 細胞陽性率較10 μg/L 時升高，二者相比有統計學意義，而隨著劑量繼續增加至40 μg/L時，TH 細胞陽性率未再繼續升高。說明GDNF 在10 μg/L～20 μg/L 范圍內存在劑量依賴性。在實驗組B(dbcAMP)中，我們同樣設置了3 個不同劑量組:100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L，其中濃度為100 μmol/L 時與血清誘導組相比TH 細胞陽性率升高，當劑量增加到200 μmol/L 時，TH 細胞陽性率較100 μmol/L 時升高，二者相比有統計學意義，而隨著劑量繼續增加至400 μmol/L 時，TH 細胞陽性率未再繼續升高。同樣，dbcAMP 在100 μmol/L～200 μmol/L 范圍內也存在劑量依賴性。綜合實驗組A及實驗組B 的實驗結果，我們在實驗組C 中利用二者的最佳濃度進行誘導，結果顯示二者聯合誘導較單獨誘導時更能促進NSCs 向多巴胺能神經元分化，二者聯合具有協同作用。實驗結果表明:在神經營養因子的作用下，分離的神經干細胞能夠快速增殖并形成神經球，GDNF 及dbcAMP 均有誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的作用，其中GDNF 在20 μg/L 時誘導效能最高，dbcAMP 在200 μmol/L 時誘導效能最高。二者聯合誘導作用更佳。

本實驗雖然獲得了預期結果，但仍有一些問題有待進一步研究，比如，如何獲得用于移植的高純度NSCs;GDNF 及dbcAMP 二者誘導NSCs 分化為多巴胺神經元的比例還不是很高;如何誘導出統一的異質性較低的不同分化階段的有功能的多巴胺神經元尚需進一步的努力;誘導分化機制還有待進一步闡明等。

3.3 NSCs 向多巴胺能定向分化研究應用于臨床存在的問題

目前的相關研究中，重點關注原生的或者轉基因的干/前體細胞在功能障礙的紋狀體中是否能夠存活、分化及功能融合等問題，包括從培養到移植后功能鑒定的各個環節都需要優化。迫切需要優化的問題可能有以下幾個方面:首先，多巴胺神經元異質性問題。在相關的人胚胎干細胞分化為多巴胺神經元的報道中，顯示同為TH 陽性的細胞中卻存在著明顯的異質性，而定向分化的多巴胺細胞的同質性是細胞移植治療的必要條件。雖然人們已經從生物化學、遺傳學、免疫細胞化學和電理生理學特性方面證明:來源于人胚胎干細胞中腦腹側的永生的多克隆神經干細胞系可以作為產生A9 多巴胺神經元的有效模式系;但是在帕金森大鼠長期體內移植的研究表明，該移植物尚不能均勻的成熟［12］。Datta I 等［13］用嚴格的無血清營養添加合適的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)使人胚胎干細胞系9(human embryonic stem cell-line，HUES9)相對比較均一的向多巴胺能神經元定向分化，但其移植后細胞的存活率及功能有待測定。因此，如何篩選出以同質性和克隆性為特點的NSCs，允許具有可控性能的細胞進行移植，是目前學者對移植細胞長期體內存活的進一步嘗試。

其次，移植前多巴胺細胞的分化程度問題。Moon［14］應用一種PD 基因模型-無晶狀體小鼠，分別在擬胚體(Embryoid Body，EB)、神經前體細胞(Neural Precursor Cells，NP)和已分化的神經元(Differented neurons ND)階段對該模型進行細胞移植治療，結果表明NP 階段代表移植的最佳階段。

再次，移植后細胞的存活時間和功能問題。Ziavra［15］將6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)立體定位注射于小鼠右側上行黑質紋狀體多巴胺通路中并隨后執行NPC 移植，接著進行脫水嗎啡誘導的旋轉和雙向免疫激光共聚焦掃描實驗。結果顯示，移植細胞至少存活3W，移植的神經前體細胞占宿主紋狀體區域的總體細胞數的百分比從0.2%(移植0W)上升到0.6%(移植3W);移植細胞功能整合在紋狀體中，明顯的減少了脫水嗎啡處理后產生的對側旋轉動作。同時，在紋狀體環境中GFP 陽性細胞分化成β-III 微管表達的神經元，而不是膠質細胞。最重要的是，GFP-陽性的細胞進一步分化為多巴胺能(TH-陽性)和中型多棘神經元(dopamine and adenosine 3’5’-monophosphate-regulated phosphoprotein，Mr 32 kD，DARPP-32-陽性)表型。

另外，用于臨床試驗中的干細胞來源問題。目前研究發現以體外產生的早期妊娠骨髓間充質為來源的神經前體細胞在體內能夠最終分化，并且能夠改善與帕金森相關的運動功能。因此胎盤可能是治療神經疾病的干細胞良好來源［16］，或者說胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)是帕金森疾病替代治療(中腦多巴胺神經元)的一個有前景的資源［17］。但是，ESC 的移植模式伴隨著介入不適應和致瘤細胞的風險。來自于轉基因系的經流式細胞儀純化的細胞移植表明:中期和晚期的細胞移植物幾乎全部是唯一的DA 神經元。中期神經元細胞移植表現出DA 神經元存活量最大并在帕金森小鼠模型中誘導出強大的運動缺陷的恢復。因此，胚胎干細胞中期分化的神經元最適合進行DA 神經元移植。

3.4 神經干細胞移植治療PD 的展望

PD 是中老年人常見神經系統變性疾病，主要病理改變是路易小體形成和黑質多巴胺能神經元缺失，由于其病因及發病機制尚未徹底明了，雖然通過多巴胺替代療法可以改善癥狀，但并不能阻止病情進展，而且藥物替代治療不可避免的副作用也限制其臨床長期應用。神經干細胞的發現為帕金森病的治療提供了新的思路和方法。通過移植多巴胺能神經元替代已經變性的神經元，恢復黑質紋狀體多巴胺系統的完整性并改善其功能，神經干細胞治療可能是帕金森病眾多治療方案中一項非常有前途的治療措施。目前已有很多關于應用神經干細胞治療PD 的基礎及臨床實驗研究。Mimura 等［18］證實腦內多巴胺能神經元移植可以使帕金森動物模型的行為學得到改善。2005 年Takagi 等［19］在猴的胚胎干細胞中加入FGF20 進行誘導分化，培養出大量多巴胺能神經元，后移植到經1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-phenyl-1，2，3，6-tetrahydro pyridine，MPTP)處理的帕金森模型猴，移植后性能鑒定試驗發現存活的移植細胞能夠行使多巴胺神經元的功能，并顯著改善帕金森病模型猴的行為學癥狀。由于MPTP 誘導產生的帕金森病模型非常接近人類帕金森病，因此實驗結果對于細胞移植應用于臨床具有極高的預測性［20］。Levesque 從神經外科手術中獲得了皮質及皮質下腦組織，并從中成功分離出大量神經干細胞進行原代培養數月，經誘導分化，培養出大量多巴胺能神經元及γ-氨基丁酸能神經元后，研究人員將其移植到帕金森病患者的大腦紋狀體內，應用帕金森病統一評分量表進行評估，結果顯示:術前服用抗帕金森藥物的患者癥狀改善達81%;移植術后2 y 該批患者癥狀改善達83%，術后5 y 評分回歸基線。該實驗表明移植的神經元能長時間的改善帕金森病患者的癥狀，同時也證明神經干細胞移植治療帕金森病的前景非常誘人［21］。因此，獲得足夠數量的多巴胺能神經元是細胞移植的基礎，而且移植源能夠改善帕金森模型鼠的行為學癥狀，說明細胞移植治療在理論上是可行的。任何可以顯著提高神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法或方式都是值得嘗試的;在不違背倫理學的基礎上，更多的從來源、定向分化到移植到功能改善的各個環節的優化都是值得探索的。

圖1 原代培養24 h 細胞克隆(×200)

圖2 原代培養3 d 細胞克隆(×200)

圖3 未加一抗細胞陰性對照(DAB，×200)

圖4 特異性標記物Nestin 表達(DAB，×200)

圖5 未加一抗細胞陰性對照(DAB，×400)

圖6 細胞中Brdu 表達(DAB，×400)

圖7 TH 細胞在分化中的陰性表達(DAB，×400)

圖8 GDNF 10 μg/L 誘導7d TH細胞表達(FITC，×400)

圖9 GDNF 20 μg/L 誘導7dTH 細胞表達(FITC，×400)

圖10 dbcAMP 100 μmol/L 誘導7d TH 細胞表達(DAB，×400)

圖11 dbcAMP 200 μmol/L 誘導7d TH 細胞表達(DAB，×400)

圖12 GDNF 20 μg/L 聯合dbcAMP 200 μmol/L 誘導7d TH 細胞表達(DAB，×400)

［1］Gage HF.Mammalian neural cells［J］.Science，2000，287(5457):1433-1438.

［2］Harrower TP，Tyers P，Hooks Y，et al.Long-term survival and integration of porcine expanded neural p recursor cell grafts in a rat model of Parkinson‘s disease［J］.Exp Neurol，2006，197(1):56-69.

［3］Wong AM，Hodges H，Horsburgh K.Neural stem cell grafts reduce the extent of neuronal damage in a mouse model of global ischaemia［J］.Brain Res，2005，1063(2):140-150.

［4］Doetsch F，Scharf C.Challenges for brain repair:Insights from adult neurogenesis in birds andmammals［J］.Brain Behav Evol，2001，58(5):306-322.

［5］張文治，蘇 心，秦進喜，等.EGF 和bFGF 促神經干細胞增殖與分化研究［J］.現代神經疾病雜志，2002，2(6):354-359.

［6］Svendsen CN，Caldwell MA，Shen J，et al.Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplantation into a rat model of Parkinson disease［J］.Exp Neurol，1997，148:135-146.

［7］郭雨霽，李盛芳.神經營養因子家族及其受體的研究進展［J］.神經解剖學雜志，2001，17(3):288-294.

［8］Schuchardt A，D’Agati V，Larsson-Blomberg L，et al.Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret［J］.Nature，1994，3670:380-383.

［9］Tio M，Tan HK，Lee W，et al.Roles of dbcAMP，IBMX and RA in Aspects of Neural Differentiation of Cord Blood Derived Mesenchymal-LikeStem Cells［J］.Plos One，2010，5(2):1-11.

［10］Tremblay RG，Sikorska M，Sandhu JK，et al.Differentiation of mouse Neuro 2A cells into dopamine neurons［J］.Journal of Neuroscience Methods，2010，186:60-67.

［11］Majd S，Smardencas A，Parish CL，et al.Development of an in vitro model to evaluate the regenerative capacity of adult brain-derived tyrosine hydroxylase-expressing dopaminergic neurons［J］.Neurochem Res，2011，36(6):967-977.

［12］Ramos-Moreno T，Lendínez JG，Pino-Barrio MJ，et al.Clonal human fetal ventral mesencephalic dopaminergic neuron precursors for celltherapyresearch［J］.PLoS One，2012，7(12):52714.

［13］Datta I，Ganapathy K，Tattikota SM，et al.Directed differentiation of humanembryonic stem cell-line HUES9 to dopaminergic neurons in a serum-freedefined culture niche［J］.Cell Biol Int，2013，37(1):54-64.

［14］Moon JS，Lee HS，Kang J，et al.Stem cell grafting improves both motorand cognitive impairments in a genetic model of Parkinson’s disease，the aphakiamouse［J］.Cell Transplant，2012.［Epub ahead of print］.

［15］Ziavra D，Makri G，Giompres P，et al.Neural stem cells transplanted in a mousemodel of Parkinson’s disease differentiate to neuronal phenotypes and reducerotational deficit［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2012，11(7):829-835.

［16］Park S，Kim E，Koh SE，et al.Dopaminergic differentiation of neural progenitorsderived from placental mesenchymal stem cells in the brains of Parkinson’sdisease model rats and alleviation of asymmetric rotational behavior［J］.Brain Res，2012，1466:158-166.

［17］Ganat YM，Calder EL，Kriks S，et al.Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment［J］.Clin Invest，2012，122(8):2928-2939.

［18］Mimura T，Dezawa M，Kanno H，et al.Behavioral and histologicalevaluation of a focal cerebral rat model transplanted with neurons induced from bone marrow stromal cells［J］.Neuropathol Exp Neurol，2005，64(12):1108-1117.

［19］Takagi Y，Takahashi J，Saiki H，et al.Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model［J］.Clin Invest，2005，115(1):102-109.

［20］Langston JM.The promise of stem cells in Parkinson’s disease［J］.Clin Invest，2005，15(1):23-25.

［21］Levesque M.Neural stem cells-derived biotherapeutics for human degenerative disorders:Clinical experience in Parkinson’s disease［C］.BIT’s 3rd Annual world congress of regenerative medicine and stem cells，2010.253.