依達拉奉對大鼠延髓缺血后神經元凋亡微血管密度的影響

朱 江，周立立，趙 亮，高燕軍，蔡 芫

細胞凋亡是一種以細胞DNA 早期降解為特征，具有特征性形態變化和生化改變的細胞主動死亡過程，不同于細胞壞死過程［1］。在腦缺血性損傷發生發展過程中，損傷后遲發性神經元死亡主要來源于凋亡途徑［2］，凋亡神經元的數量直接決定著神經元壞死數量和缺血區域的面積，及時抑制凋亡是挽救凋亡前期神經元的關鍵［3］。腦部缺血性疾病發生后，腦組織中自由基的過度產生是導致神經元、血管內皮細胞凋亡的主要因素。

依達拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一種有效的自由基清除劑。因其分子質量小、脂溶性高，能阻斷氧化應激，抑制脂質過氧化［4］，給藥后可抑制自由基的產生，從而減輕腦缺血引起的組織損傷，臨床上主要用于腦缺血疾病的治療［5，6］。

本實驗將依達拉奉應用于實驗模型中，利用其清除自由基、抑制脂質過氧化的藥理作用，探討自由基清除劑對大鼠延髓缺血神經元、微血管的保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 SPF 級Wistar 成年健康雄性大鼠，220～260 g，購于河北醫科大學實驗動物中心。72 只大鼠隨機分為3 組:假手術組、實驗組、缺血對照組。按時間點分為7 d、14 d 兩個亞組，每組6 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結扎右側頸總動脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養。

1.2.2 實驗動物的干預方法 假手術組只暴露雙側椎動脈及右側頸總動脈，不做血管阻斷處理。實驗組、缺血對照組均在阻斷雙側椎動脈及右側頸總動脈后立即開始治療。實驗組每天腹腔注射依達拉奉兩次，時間間隔12 h，每次注射計量按3 mg/kg計算，到術后7 d 和14 d 兩個時間點分別處死，取延髓。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術后7 d 和14 d 兩個時間點分別處死，取延髓。

1.2.3 實驗標本制作 應用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預先處理為鈍圓的針頭插入左心室內，快速輸入溫生理鹽水(37 ℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol 磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4 Tunel 法操作步驟(1)組織切片至于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min，用無水乙醇洗2×3 min，95%乙醇、90%乙醇各洗一次，每次3 min，蒸餾水洗兩次;(2)將組織切片置于蛋白酶K(20 μg/ml，pH 7.4)溶液中，室溫孵育15 min;(3)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次;(4)擦干樣品周圍的水，滴加50 μl 的Tunel 反應混合液溶液，在溫盒中37 ℃孵育60 min;(5)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次;(6)擦干樣品周圍的水份，加入50 μl 的轉化劑-POD，在溫盒中37 ℃孵育30 min;(7)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次;(8)加入50 μl 的DAB 底物溶液，室溫孵育10 min;(9)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3次;(10)依次分別用70%、95%、100%乙醇脫水，干燥;(11)二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5 尼氏染色主要步驟(1)組織貼片自然晾干;(2)無水乙醇+氯仿(1∶1)4 h;(3)100%乙醇(Ⅰ)3 min;(4)100%乙醇(Ⅱ)3 min;(5)95%乙醇3 min;(6)70% 乙醇3 min;(7)50% 乙醇3 min;(8)雙蒸水1 min;(9)1%甲苯胺藍染液，60 ℃恒溫箱內染色50 min;(10)雙蒸水浸泡數遍;(11)50%乙醇1 min;(12)70%乙醇(含1%冰醋酸)數秒鐘，注意觀察切片分色情況;(13)95%乙醇(Ⅰ)1 min;(14)95%乙醇(Ⅱ)1 min;(15)100%乙醇(Ⅰ)1 min;(16)100%乙醇(Ⅱ)1 min;(17)二甲苯(Ⅰ)5 min;(18)二甲苯(Ⅱ)5 min;(19)中性樹膠封片。

1.2.6 神經元計數及凋亡神經元定量分析每只大鼠取3 張切片(片厚20 μm)，每張切片在400 倍光鏡下隨機選取5 個視野，輸入醫學顯微圖像分析系統(MiVnt)進行圖像處理。計數神經元及凋亡神經元，取其平均值為這只大鼠的神經元及凋亡神經元的細胞數。其中，凋亡神經元在光鏡下呈現棕黃色［7］。

1.2.7 單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度的變化 每只大鼠取3 張切片，采用Mivnt 圖像分析系統定量分析延髓微血管密度(microvesser density，MVD)。每張切片在100 倍光鏡下選5 個視野，計算MVD 值，取平均值作為該只大鼠延髓微血管的MVD 值。

1.2.8 統計學處理 用SPSS13.0 統計軟件包處理，數據用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦組織中神經元數量的變化 通過對7 d、14 d 后實驗動物的觀察，實驗組及缺血對照組中神經元的數量較假手術組明顯減少。實驗組神經元減少幅度在各時段均低于缺血對照組。同時，實驗組神經元凋亡的幅度較缺血對照組的幅度低。與假手術組相比較有統計學差異(見表1、表2)。

2.2 各組腦組織中微血管密度(MVD)的變化通過對7 d、14 d 后實驗動物的觀察，實驗組及缺血對照組的微血管密度(MVD)值較假手術組均減少。但是，實驗組MVD 數值減少的幅度低于缺血對照組。與假手術組相比較二者均有統計學差異(見表3)。

表1 各組大鼠腦組織中神經元數量比較(±s)

表1 各組大鼠腦組織中神經元數量比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 各組大鼠腦組織中神經元凋亡數量比較(±s)

表2 各組大鼠腦組織中神經元凋亡數量比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表3 各組大鼠腦組織中MVD 含量的比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織中MVD 含量的比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

細胞凋亡是真核細胞常見的死亡形式，是機體為維持自身穩態而進行的。凋亡細胞在細胞核和細胞質結構上常出現特征性改變，如DNA 斷裂、細胞核解體及凋亡小體形成等［8］。細胞凋亡的發生一方面與基因表達內在性因素有關，更重要的則與自由基、興奮性氨基酸等外在性因素有關［9］，繼而引起遲發性神經死亡［10］。

在延髓缺血后，出現神經元數量及微血管密度的減少。在缺血條件下，神經膠質細胞大量增生填充于壞死區域，從而進一步影響到微循環，引起局部微循環障礙。進一步加重神經元的缺血，繼而引起遲發性神經元死亡，出現大量神經元胞體凋亡。

通過本實驗結果可見，實驗組延髓組織的神經元減少的數量、凋亡神經元的數量均低于缺血對照組，提示依達拉奉可通過清除自由基抑制神經元凋亡從而起到保護神經元的作用。實驗組中延髓組織內微血管密度較缺血對照組高，說明依達拉奉在延髓缺血過程中通過清除自由基，減輕了微血管內皮細胞損傷，進一步維持神經元單元內部的穩態結構。

本實驗結果提示，延髓缺血后由于自由基產生，改變了神經元及微血管所處內環境的穩態結構，出現病灶局部微循環改變，出現遲發性神經元死亡。依達拉奉通過清除自由基，抑制凋亡發生，減輕血管內皮細胞損害，改善了微循環障礙，發揮了對神經細胞的保護作用。

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