褪黑素減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷

林 達(dá)，陳敬寅，李建儒，陳 高

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的發(fā)生率大約為1/10，000，具有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)［1］。最新的研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷(early brain injury，EBI)可能是導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血患者死亡率高的因素之一。其可能的機(jī)制包括腦血流量的降低、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的破壞以及腦水腫［2］。

同時(shí)目前的研究也表明神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡也是早期腦損傷的一個(gè)重要因素并且是決定該疾病短期以及長(zhǎng)期預(yù)后，特別是認(rèn)知功能預(yù)后的一個(gè)重要因素［3，4］。因此，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷可以有效地降低遲發(fā)的缺血性損傷的嚴(yán)重程度，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的神經(jīng)預(yù)后。褪黑素(N-乙酰-5-氧基色胺)由松果體分泌，具有強(qiáng)烈的抗氧化作用，其可能的作用機(jī)制為褪黑素及其代謝物可以清除氧自由基，激活抗氧化酶，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，促進(jìn)其他抗氧化劑的活化，并且可以保護(hù)抗氧化酶，所以是非常有效的抗氧化劑［5～8］。而且褪黑素能夠透過(guò)血腦屏障，即使大劑量應(yīng)用也并未監(jiān)測(cè)到毒性損傷［9，10］。盡管如此，褪黑素對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用仍沒(méi)有明確。

本研究擬觀察褪黑素是否能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和穩(wěn)定血腦屏障來(lái)減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷和神經(jīng)功能的改善。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 體重300～330 g 的SD成年雄性大鼠購(gòu)自Slac 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司(中國(guó)上海)。大鼠隨機(jī)分為3 組，即假手術(shù)組(假手術(shù)+溶劑)、SAH 組(SAH+溶劑)、SAH+MEL 組(SAH+褪黑素)。這項(xiàng)研究所有的終點(diǎn)都設(shè)定在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型建立后24 h。所有實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容均得到了浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型 我們依照文獻(xiàn)［11］介紹的方法建立大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。通過(guò)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(40 mg/kg)對(duì)大鼠實(shí)施麻醉，快速暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及其分支。從遠(yuǎn)端切斷左側(cè)頸外動(dòng)脈，使由此產(chǎn)生的斷端與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線。將一根鈍頭的4-0 單絲尼龍縫線通過(guò)頸外動(dòng)脈斷端伸入頸內(nèi)動(dòng)脈，超過(guò)頸內(nèi)頸外動(dòng)脈分叉處約18～20 mm，直到有阻力感。繼續(xù)將單絲尼龍縫線推進(jìn)約3 mm，即在靠近頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)分叉處刺穿頸內(nèi)動(dòng)脈。大約15 s 后退出單絲尼龍縫線。我們依據(jù)文獻(xiàn)公布的分級(jí)量表［12］來(lái)評(píng)價(jià)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血的嚴(yán)重程度，對(duì)6 段基底池蛛網(wǎng)膜下腔的血液量做分級(jí)。0 分，沒(méi)有蛛網(wǎng)膜下腔出血;1 分，極少量蛛網(wǎng)膜下腔出血;2 分，中等量血并可見(jiàn)動(dòng)脈;3分，血凝塊覆蓋了分段區(qū)域內(nèi)的所有動(dòng)脈。通過(guò)對(duì)6 個(gè)分段區(qū)域的分?jǐn)?shù)相加可以得到該蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的得分(0～18)。

1.3 藥物治療 褪黑素購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯，密蘇里州，美國(guó))。把褪黑素(150 mg/kg)溶解于含1%乙醇的生理鹽水溶劑中，在蛛網(wǎng)膜下腔出血2 h 后注射入SAH+MEL 組大鼠腹腔內(nèi)。假手術(shù)組和SAH 組均在對(duì)應(yīng)的相同時(shí)間點(diǎn)按體重注射等量的溶劑。

1.4 死亡率和神經(jīng)功能障礙的評(píng)估 在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型建立后24 h，進(jìn)行死亡率和神經(jīng)功能障礙評(píng)估。神經(jīng)功能評(píng)分依據(jù)加西亞評(píng)分系統(tǒng)［13］。對(duì)大鼠的自發(fā)性活動(dòng)、四肢活動(dòng)的對(duì)稱(chēng)性、前腳外伸、爬行、軀干本體感覺(jué)以及對(duì)觸須觸碰的反應(yīng)進(jìn)行觀察評(píng)定，每個(gè)測(cè)試計(jì)0～3 分或1～3 分，總分值范圍從3～18 分。所有測(cè)試分值的評(píng)定都由對(duì)分組及治療情況不知情的觀察者來(lái)完成，同時(shí)對(duì)動(dòng)物行為測(cè)試的順序是隨機(jī)的。較低的得分表明存在嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。在同樣的時(shí)間點(diǎn)計(jì)算各組大鼠的死亡率。

1.5 腦含水量的測(cè)定 在蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后處死大鼠。立即取出腦組織并稱(chēng)重得到濕的重量，然后在105 ℃情況下烘干24 h 后稱(chēng)重得到干的重量。通過(guò)公式(濕的重量－干的重量)/濕的重量×100%計(jì)算得到腦組織的水含量［14］。

1.6 血腦屏障完整性的評(píng)價(jià) 在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型建立后24 h，將2%伊文思藍(lán)(5 mg/kg)經(jīng)左側(cè)股靜脈注入大鼠體內(nèi)，并循環(huán)1 h。在深度麻醉后，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)溶液經(jīng)心室內(nèi)灌注后取腦。將目標(biāo)測(cè)定區(qū)域的腦組織稱(chēng)重后浸潤(rùn)在3 ml PBS 中制成勻漿，然后15000×g 下離心30 min。取0.7 ml 上液與等體積的三氯乙酸-乙醇(1∶3)混合液混合。經(jīng)4 ℃下孵育過(guò)夜后，將樣品于15000×g 下離心30 min，并作激發(fā)光波長(zhǎng)620 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)680 nm 的分光熒光測(cè)定。

1.7 組織學(xué)和TUNEL 染色 大鼠處死后用0.1 mmol 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)和4%多聚甲醛(pH 7.4)注入心臟。取腦放入相同的固定液，置于4 ℃環(huán)境中2 d。然后，將腦置于組織冷凍介質(zhì)中冷凍，并切成7 μm 的切片。TUNEL 染色依據(jù)試劑生產(chǎn)廠家標(biāo)明的方法進(jìn)行，選取冠狀位相同位置的皮層切片，在400 倍熒光顯微鏡(LSM-710，Zeiss)下觀察拍照并測(cè)定相同大腦皮層區(qū)TUNEL 陽(yáng)性(綠色)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞核(DAPI，藍(lán)色)數(shù)，取TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞核數(shù)百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡 將大鼠處死后用pH 7.4 的PBS 作心內(nèi)灌注，取左側(cè)基底皮質(zhì)樣品(面對(duì)血塊)制成勻漿，在4 ℃下以1000×g 離心10 min。將所得上液進(jìn)一步離心分離，使用CD 蛋白定量試劑(Bio-Rad)測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白(60 μg)重懸于同樣的緩沖液中，95 ℃變性5 min，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離。蛋白在80 V 電泳分離3 h 后，于100 V 經(jīng)2 h，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜經(jīng)脫脂牛奶封閉后，加入檢測(cè)蛋白:一抗caspase-3(1∶1000，sc-22140，Santa Cruz Biotechnology)。膜經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗于21 ℃下孵育1 h 后，使用X 光膠片檢測(cè)蛋白條帶，并作定量分析(NIH)。

2 結(jié)果

2.1 生理學(xué)評(píng)價(jià) 在手術(shù)過(guò)程中監(jiān)測(cè)的動(dòng)脈壓、動(dòng)脈血pH 值、p(O2)、p(CO2)、血糖水平間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 死亡率、神經(jīng)功能障礙以及蛛網(wǎng)膜下腔出血分級(jí) 假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡，SAH 組死亡率為12/35(33.3%);SAH+MEL 組死亡率為5/28(17.9%)。假手術(shù)組、SAH 組及SAH+MEL 組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別為17.8±0.4、10.9±0.7、12.3±1.2。SAH 組神經(jīng)功能得分顯著低于假手術(shù)組(10.9±0.7 vs 17.8±0.4，P＜0.05)。SAH+MEL 組大鼠的神經(jīng)功能缺損較SAH 組明顯減輕(12.3±1.2 vs 10.9±0.7，P＜0.05)。同時(shí)在取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔血凝塊主要分布在同側(cè)的Willis 環(huán)和腦干表面，假手術(shù)組、SAH 組和SAH+MEL組的蛛網(wǎng)膜下腔出血分級(jí)分?jǐn)?shù)分別為(0±0)、(13.47±1.5)、(13.45±1.1)。SAH 組與SAH+MEL 組之間的蛛網(wǎng)膜下腔出血評(píng)分無(wú)顯著性差異。

2.3 褪黑素對(duì)腦含水量的影響 蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，假手術(shù)組大鼠的腦含水量為79.2%;SAH 組大鼠的腦含水量為80.0%;SAH+MEL 組大鼠的腦含水量為79.5%。與假手術(shù)組相比，SAH 組的腦含水量增加0.8%(79.2% vs 80.0%，P＜0.05)。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠的腦含水量明顯降低(79.5% vs 80.0%，P＜0.05)。

2.4 褪黑素對(duì)血腦屏障的影響 伊文思藍(lán)染料外滲是血腦屏障破壞的一項(xiàng)指標(biāo)。蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，與假手術(shù)組相比，SAH 組大鼠的目標(biāo)測(cè)定區(qū)域腦組織伊文思藍(lán)滲出明顯增多(P＜0.05)。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠目標(biāo)測(cè)定區(qū)域腦組織伊文思藍(lán)滲出明顯減少(P＜0.05)。

2.5 褪黑素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 在假手術(shù)組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，SAH 組大鼠的基底部皮質(zhì)可發(fā)現(xiàn)大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。與SAH 組相比，褪黑素治療可以明顯減少基底部皮質(zhì)中的TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞(P＜0.05)。

2.6 褪黑素對(duì)caspase-3 表達(dá)的影響 我們?cè)诖笫笞竽X基底部皮質(zhì)中檢測(cè)caspase-3 的表達(dá)。褪黑素可以抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血誘導(dǎo)的caspase-3 表達(dá)的升高。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠左腦基底部皮質(zhì)中的caspase-3 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。

表1 不同組間生理狀態(tài)比較

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷的機(jī)制非常復(fù)雜，涉及顱內(nèi)壓的升高、腦灌注壓的降低、凋亡、壞死、自噬、血腦屏障障礙、氧化應(yīng)激和炎癥等［15］。近期的研究發(fā)現(xiàn)，很多藥物在某一方面對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷有保護(hù)作用，然而更多的研究表明，只有那些具有多重保護(hù)機(jī)制的藥物才能在近期和遠(yuǎn)期預(yù)后中能起到較為切實(shí)有效的作用。在實(shí)驗(yàn)中，我們研究了褪黑素在早期腦損傷中的作用，并且研究了它對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠腦組織細(xì)胞凋亡、血腦屏障功能障礙、腦水腫、神經(jīng)功能障礙和死亡率的影響。我們的研究表明，在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血2 h后腹腔注射褪黑素顯著改善了蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h時(shí)的預(yù)后，降低了大鼠的死亡率，改善了大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分。

在蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期，通常可以觀察到血腦屏障的破壞、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙以及隨后的腦水腫。而繼發(fā)于這些改變的便是顱內(nèi)壓升高、嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙和較高的死亡率［16，17］。在我們的研究中，我們?cè)谥刖W(wǎng)膜下腔出血后24 h 也發(fā)現(xiàn)了SAH 組大鼠存在腦水腫和血腦屏障破壞，但通過(guò)褪黑素治療可以減輕腦水腫和血腦屏障的破壞程度。

很多研究已經(jīng)確定在動(dòng)脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血過(guò)程中，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞都會(huì)發(fā)生凋亡［18，19］。我們的結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織的相關(guān)區(qū)域凋亡水平上升，而通過(guò)褪黑素的治療可以降低其上升程度。另外，有證據(jù)表明外源性和內(nèi)源性凋亡機(jī)制在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的細(xì)胞凋亡過(guò)程中均被激活［20，21］，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制主要涉及caspase-3、caspase-8 以及caspase-9，因而在蛛網(wǎng)膜下腔出血后抑制它們的活性對(duì)近期和遠(yuǎn)期的預(yù)后均是有益的［11，22，23］。我們的研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血早期褪黑素治療可以降低caspase-3 的表達(dá)，從而降低蛛網(wǎng)膜下腔出血后的細(xì)胞凋亡水平，改善神經(jīng)功能。

總之，我們的研究表明大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期褪黑素治療有降低細(xì)胞凋亡水平、減輕腦水腫和保護(hù)血腦屏障的作用，并可能通過(guò)上述作用減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷，降低蛛網(wǎng)膜下腔出血的死亡率，改善神經(jīng)功能。但是褪黑素降低細(xì)胞凋亡和保護(hù)血腦屏障的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去探索研究。

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