癲癇患者腦脊液和血清中miRNA-184 的表達

楊武芬，劉 華，鄭 穎，韓雁冰，任 惠

癲癇(Epilepsy)是一組由已知或未知病因所引起的腦部神經元高度同步化異常放電所導致的綜合征，其臨床表現以反復性、發作性、短暫性、刻板性的中樞神經系統功能失常為特征，表現為發作性的感覺、運動、意識、精神、行為、自主神經功能障礙，或兼有之。流行病學調查顯示，癲癇在一般人群中的發病率為(50～70)/10 萬，患病率為0.4%～1%［1］。在癲癇發病過程中，反復癇性發作可造成腦組織缺血缺氧、水腫誘發興奮性氨基酸釋放、鈉鈣內流，從而啟動Caspase 級鏈反應等，產生了自由基、神經一氧化氮合酶以及介導凋亡的核心執行蛋白激酶Caspase-3，使細胞質、細胞核及細胞骨架的重要蛋白質降解失活，造成大量神經元凋亡、缺失，而這些神經元損傷是導致慢性自發性癲癇發生的原因之一，最終可能形成難治性顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)。通過觀察神經元損傷敏感標志物神經特異性烯醇化酶表達發現癲癇發作導致海馬區錐體神經元脫失，是神經元損傷的結果，且發作級別越高，損傷越大［2］。癲癇動物模型研究表明，癲癇發作可導致海馬、杏仁核、大腦皮質、丘腦及小腦等部位神經元的喪失［3］。

MicroRNAs(miRNAs)是1993 年發現的一種長度為20～24 個核苷酸的內源性非編碼蛋白的小RNA 基因，主要是通過與靶基因的3’端非翻譯區(3’untranslated regions，3’-UTR)互補配對抑制靶基因轉錄后表達，抑制mRNA 翻譯或使mRNA 降解。已發現的miRNA 中，約70%在哺乳類動物的腦組織中有表達，在神經系統的不同生理過程、不同信號傳導通路的基因表達調控過程中發揮重要作用，如神經系統發生和發育、神經干細胞分化、細胞凋亡等過程中發揮重要作用［4］。研究發現miRNA-184 主要表達于海馬CA3區和CA1區，而且通過抑制AKT2的表達來抑制神經元的凋亡［5］，通過與甲基化CPG結合蛋白1(MBD1)和Numb1 相互調節，來維持aNSCs 的增殖與分化的平衡［6］。由于癲癇患者人腦組織取材困難，及時取得標本，對人離體腦組織進行直接檢測miRNA 的表達也極為不易，而腦脊液主要產生于側腦室的脈絡叢組織中，且包繞腦實質、與腦細胞外隙直接接觸，可以動態反映腦組織內病理生理變化。因此，我們擬以腦脊液和血清為研究對象，觀察體液中miRNA-184 的變化與腦組織中miRNA-184表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 所有研究對象均為2010 年2月～2013 年1 月在昆明醫科大學第一附屬醫院的住院患者，共78 例。分為兩組:(1)癲癇組:所有入選的癲癇患者的診斷均符合1989 年ILAE 提出的癲癇及癲癇綜合征分類診斷標準和腦電圖的表現。(2)對照組:共39 例，入選標準為:①年齡、性別與癲癇組患者匹配;②排除既往及現在的癲癇發作病史。

1.2 標本的采集 確診為癲癇，且在癲癇發作后0～15 d 之內，進行腰椎穿刺，留取腦脊液2 ml 同時抽取外周血3～4 ml，在留取標本后6 h 之內用微離心機離心(3000 r/min，離心10 min)，取血清和腦脊液上清分開放入EP 管內，每個EP 管至少放200 μl，保存至-80 ℃冰箱。在相同時間內抽取非癲癇病住院患者的腦脊液和外周血，進行上述處理。整個過程中使用的器械均進行去RNA 酶處理。

1.3 熒光定量PCR 取-80 ℃保存的腦脊液和血清室溫下解凍，提取總RNA，采用miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑盒(QIAGEN 公司)，按操作說明書抽提。提取的總RNA 樣本中加入RNase-free 水完全溶解RNA 沉淀后，保存在-80 ℃ 冰箱中。RNA 的濃度和純度用260/280 nm 檢測，260/280 nm在1.8～2.0 之間可以用于后續實驗。反轉錄實驗采用QIAGEN 公司的反轉錄試劑盒，步驟為:(1)37 ℃for 60 min;(2)95 ℃ for 5 min。本實驗選miRNA-16［7］作為血清的內參，以miRNA-24［8］作為腦脊液內參平衡樣本量。熒光定量PCR 擴增反應的miRNA-184、miRNA-16、miRNA-24 特異性環莖狀引物購買于QIAGEN 公司。反應在96 孔PCR 板中進行，每個反應做3 個復孔。PCR 反應體系為20 μl，SYRB Green 熒光染料(QIAGEN 公司)10 μl，上下游引物各2 μl，去RNase 的純凈水4 μl，CDNA模板2 μl。反應條件為:(1)95 ℃，15 min;(2)94 ℃，15 s;(3)55 ℃，30 s;(4)70 ℃，34 s;(5)在第2～4 步間循環45 次。在Applied Biosystems 7300 擴增儀上進行擴增。結果用平均2-ΔCt±標準差計算。表達量的相對倍數用癲癇發作后2-ΔCt/對照2-ΔCt計算。

1.4 統計分析 全部數據統計分析采用SPSS 18.0 統計軟件，對各組腦脊液和血清中miRNA-184的表達量，使用軟件分析計算閾值(Ct)，2-ΔCt(ΔCt=目標基因的CT 值-內參基因的CT 值)來比較兩組中miRNA-184 表達的不同，用±s 表示，多組之間的比較采用配對樣本t 進行檢驗，兩組中P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組人口學資料 本研究共納入78 例患者，其中癲癇組和非癲癇對照組患者各39 例，兩組間年齡、性別無統計學差異(見表1)。

2.2 實時定量PCR 結果 miRNA-184 在癲癇患者及非癲癇患者腦脊液中的表達情況見表2 和圖1。miRNA-184 在癲癇患者腦脊液中表達水平明顯高于非癲癇患者(P＜0.05)，且表達量增高4.67倍。miRNA-184 在癲癇患者及非癲癇患者血清中的表達情況見表3 和圖2。miRNA-184 在癲癇患者血清中表達水平明顯低于非癲癇患者(P=0.029＜0.05)。對比miRNA-184 在癲癇組與非癲癇組腦脊液和血清中的表達，發現癲癇患者腦脊液和血清中miRNA-184 的表達成相反的趨勢。

表1 癲癇組和對照組患者的人口學資料

表2 熒光定量PCR 測定miRNA-184 在癲癇患者與非癲癇患者腦脊液中的表達(±s)

表2 熒光定量PCR 測定miRNA-184 在癲癇患者與非癲癇患者腦脊液中的表達(±s)

經兩獨立樣本t 檢驗，癲癇組與對照的miRNA-184 在腦脊液中的表達有統計學差異，P=0.011＜0.05

表3 熒光定量PCR 測定miRNA-184 在癲癇患者與非癲癇患者血清中的表達(±s)

表3 熒光定量PCR 測定miRNA-184 在癲癇患者與非癲癇患者血清中的表達(±s)

經兩獨立樣本t 檢驗，癲癇組與對照的miRNA-184 在血清中的表達有統計學差異P=0.029＜0.05

圖1 miRNA-184 在腦脊液中的表達對比

圖2 miRNA-184 在血清中的表達對比

3 討論

癲癇發作可誘導腦細胞的凋亡，在癲癇持續狀態下海馬神經元凋亡明顯［9］。以往研究發現，Akt的激活可以保護癲癇所誘導的海馬神經元的凋亡［10］。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)是存在于神經細胞的一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，其Thr308 和Ser473 位點能在PI3K 作用下磷酸化而激活，隨即發揮抗細胞凋亡、促細胞生存等多種生物效應［11］。癲癇發作后海馬神經元內Akt 與miRNA-184 的表達成互惠模式，且miRNA-184 可能通過促進AKT2 的表達來抑制神經元的凋亡［5，12］。

Sato 等［13］研究發現，癇性發作誘導損傷后，在尾側腦室下區、胼胝體間區和海馬的CA1和CA3區神經干細胞增殖和遷移，出現了神經發生和可塑性改變。而癲癇持續狀態能夠加速尾側腦室下區aNSCs的增殖，其增殖與海馬的病理狀態有密切關系。liu 等［6］也曾報道，成熟的miRNA-184 局限于成人兩個持續神經元形成的區域內，分別是側腦室室管膜下和海馬齒狀回，miRNA-184 表達較高的區域具有較強的熒光信號。在神經系統中，miRNA-184通過與甲基化CPG 結合蛋白1(MBD1)和Numb1 相互調節，來維持aNSCs 的增殖與分化的平衡［6］。MBD1 主要表達于分化性aNSCs 和原代皮質神經元細胞中，而miRNA-184 主要表達于增殖性aNSCs中，而且，MBD1 通過直接與miRNA-184 周邊的基因結合而抑制aNSC 中miRNA-184 的表達，維持aNSC的增殖和分化的平衡［6］。外源性的Numbl 可以營救由miRNA-184 的過度表達或MBD1 所致的神經干細胞的缺失［14］。

以上資料說明，癲癇發作后腦組織內miRNA-184 的表達明顯升高，這與本研究發現癲癇患者腦脊液中miRNA-184 的表達明顯高于對照組相一致。由于癲癇患者人腦組織取材困難，及時取得標本，對人離體腦組織進行直接檢測miRNA 的表達也極為不易，而腦脊液主要產生于側腦室的脈絡叢組織中，不斷產生又不斷被吸收回流至靜脈，包繞腦實質、與腦細胞外隙直接接觸，可以動態反映腦組織內病理生理變化，而且，腦脊液具有采集方便，創傷性小，可早期發現腦組織的病理變化的特點。因此，觀察癲癇患者腦脊液中可溶性分子生物標志物，可能是研究腦實質病變的的有效途徑之一。

本研究還發現，癲癇患者血清中miRNA-184 的表達明顯低于對照組。這可能是因為癲癇發作促使外周血血清中的miRNA-184 向顱內流動所致。癲癇發作時血腦屏障內皮、基膜、周細胞都出現明顯的水腫，基膜電子密度降低;內皮吞飲小泡、微絨毛明顯增多，內皮細胞間的連接斷裂等改變［15］。促使BBB 破壞，BBB 通透性升高，內皮細胞從血漿內攝取、轉運物質的能力增強，導致腦脊液可出現正常或不正常的物質。因此，癲癇發作后外周血中的miRNA-184 可能透過血腦屏障進入腦脊液，到達相應區域發揮神經保護作用，所以，癲癇患者外周血中miRNA-184 的表達明顯低于對照組。但miRNA-184具體如何進入腦脊液的途徑還尚不清楚，有待進一步的研究。

本課題研究了miRNA-184 在癲癇患者體液中的表達情況，首次報道了miRNA-184 在癲癇患者腦脊液和血清中的表達變化。雖然，近年來的研究表明神經特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)是目前唯一能特異性反映神經元損傷的生物標志物。其在血清和腦脊液中的水平可反映神經元受損的程度，對早期直接而準確地了解腦損傷程度，具有重要的臨床意義。但NSE 是一種主要存在于大腦神經細胞的胞質中的特異性蛋白，NSE 檢測極易受標本放置時間影響，標本放置時間只要超過2 h，就會對NSE 檢測結果產生較大影響，NSE 的檢測標本離心須在l h 內完成，NSE 的穩定性較差［16］。但在實際工作中，檢驗項目申請、患者準備、原始標本的采集、運送到實驗室等工作是由實驗室以外工作人員完成的，實驗室工作人員很難控制，而標本的質量是準確檢驗結果的基礎。由于這些檢驗前不可控因素的影響，同一患者檢查結果出現顯著差異時有發生，影響檢驗結果的真實性和準確性。而體液和組織中的miRNA 因常與蛋白質等構成復合物存在，因此具有良好的抗RNase 降解能力，血清樣本置于室溫4 h 后檢測其miRNAs，發現與即刻檢測樣本相比miRNAs 量并未發生顯著的改變:而且即便血清經過2 次凍融處理，miRNAs 的量稍有變化，也并不影響對疾病的診斷［17］。因此，miRNAs 的穩定性較高，方便在臨床實踐中的應用。

綜上所述，本研究發現癲癇患者腦脊液中miRNA-184 的表達明顯高于非癲癇患者，這與miRNA-184 在癲癇發作后在腦組織中表達趨勢相一致。而癲癇發作后miRNA-184 在癲癇患者外周血清中的表達明顯低于非癲癇患者。癲癇發作后miRNA-184在癲癇患者腦脊液和外周血清中的表達成相反的趨勢。這說明在癲癇發作過程中miRNA-184 起一定的作用，提示觀察體液中miRNA-184 的變化可能是觀察癲癇患者腦組織病變的一個新的窗口。此項研究為進一步揭示癲癇發生發展機制提供了新的研究基礎，并可能成為臨床藥物治療癲癇的新靶點。但是，由于本課題研究的時間有限和病例數相對較少，關于miRNA-184 的表達在癲癇發作過程中如何隨著時間的變化而發生改變，且miRNA-184 的表達與癲癇發作類型的相關性還有待進一步的研究。

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