香蘭素吸嗅對大鼠抑郁樣行為及腦單胺類神經遞質的影響

劉 揚，許 慧，徐金勇，李光武

抑郁癥(major depressive disease，MDD)的治療目前主要采用5-HT 再攝取抑制劑(SSRI)等抗抑郁藥物。在肯定這些新型抗抑郁藥研究成果的同時，其療效、毒副作用及給藥途徑等依然需要研究者的繼續改進。嗅覺中樞與情緒功能腦區有著重疊。本實驗室以往研究發現芳香物質的吸嗅可以改善小鼠抑郁樣行為以及學習記憶，參與情緒、學習記憶相關腦區的激活［1］。經嗅覺通路的給藥途徑起效快、且可能避免外周副作用。香蘭素(vanillin)為一種廣泛使用的可食用香料，具有濃郁的奶香，能給人帶來積極的愉快的情感體驗，且具有抗癲癇、抗焦慮的作用［2］。本實驗通過讓抑郁模型大鼠吸嗅含有香蘭素的水蒸氣，觀察香蘭素吸嗅對抑郁大鼠行為學的改變，并檢測干預后各組大鼠腦勻漿液5-HT、DA、NE 的量，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與主要試劑 WabLab 動物行為視頻分析系統(淮北軟隆科技公司)，大鼠飲水瓶(上海生工公司)，低溫離心機(eppendorf，German)超聲勻漿機(Bio-block Scientific，France)，超高壓液相色譜-熒光檢測器(Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm，American)，BCA 蛋白試劑盒(上海生工公司)，香蘭素晶體(上海生工公司)，鹽酸氟西汀膠囊(上海中西制藥有限公司)，5-HT、DA、NE 標準品(Sigma-aldrich，American)。

1.2 實驗動物與分組 SD 大鼠50 只(安徽醫科大學動物中心提供)，SPF 級，體重220～250 g，雄性，適應性飼養1 w，室溫為(22±3)℃，正常晝夜節律，期間動物可自由飲水、攝食。抑郁造模后大鼠隨機分為5 組:實驗組:CUMS+香蘭素吸嗅(Ⅰ組)、陽性對照組:CUMS+氟西汀灌胃(Ⅱ組)、空白對照組:CUMS+純水蒸氣吸嗅(Ⅲ組)，為了驗證香蘭素作用途徑，設立OBX+香蘭素吸嗅組(Ⅳ組)和嗅球毀損假手術組(Ⅴ組)。

1.3 抑郁造模

1.3.1 CUMS+孤養的方法建立大鼠抑郁模型參考文獻［3］，大鼠每天接受一種隨機刺激，包括:禁食24 h、禁水24 h、冷水游泳(4 ℃，5 min)、熱水游泳(45 ℃，5 min)、晝夜節律顛倒、搖晃(5 min)、夾尾(3 min)。持續刺激4 w。

1.3.2 大鼠嗅球毀損(OBX)模型 OBX 是經典的抑郁癥造模方式，常用于抗抑郁藥的作用機制的研究，本實驗為了闡明香蘭素是否通過嗅覺通路起作用，故采用離斷大鼠嗅覺通路造成大鼠抑郁，然后讓大鼠吸嗅香蘭素來佐證。參考文獻［4］及結合實際，用10%水合氯醛按大鼠體重(g)×(300 μl/100 g)的量腹腔注射麻醉大鼠，大鼠全麻后頭部固定于腦立體定位儀上，大鼠腹部墊在恒溫毯上，在兩耳連線中點處做縱形切口暴露顱骨，在距前囟7 mm，與正中縫兩側旁開1.8 mm 的交點處，用牙科鉆將顱骨鉆兩個直徑約2 mm 的小孔，用注射器針頭攪動破壞嗅球后并吸出，可吸收明膠海綿填入小孔止血。假手術組大鼠采用相同的手術方法，但顱骨鉆孔后不破壞嗅球。用碘伏清洗好傷口后縫合皮膚。手術結束后將大鼠分籠飼養，以防傷口開裂感染。

1.4 干預方法

1.4.1 Ⅰ組 參考文獻［5］，將香蘭素晶體用熱水溶于燒杯，盛有香蘭素溶液的燒杯置于密閉的實驗盒底部，底部上面20 cm 高度鋪有一層帶有許多孔的薄塑料柵欄，待香蘭素水蒸氣充分揮發彌漫至整個實驗盒內，將大鼠放置于塑料柵欄上，將實驗盒蓋蓋上，大鼠吸嗅0.5 h 后，將動物取出放回籠中，3 次/d，持續4 w。

1.4.2 Ⅱ組 氟西汀按大鼠體重(g)×(10 mg/kg)灌胃，1 次/d，持續4 w。

1.4.3 Ⅲ組 大鼠置于實驗盒中吸嗅純水蒸氣，3 次/d，持續4 w。

1.4.4 Ⅳ組 干預方法同Ⅰ組。

1.4.5 Ⅴ組 正常飲水飲食，不予干預，觀察4 w。

1.5 神經行為學觀察

1.5.1 強迫游泳實驗(Forced swimming test，FST)將大鼠放入WabLab 動物行為視頻分析系統的圓柱形游泳桶中，桶底直徑20 cm、高45 cm，水溫25±1 ℃，水深30 cm 大鼠在游泳桶中適應環境1 min，然后通過視頻分析系統記錄大鼠5 min 游泳的不動時間，不動閾值設置為“7”，大鼠游泳的不動時間為停止掙扎或漂浮在水面僅有細小肢體動作的時間。于造模前、造模后和治療4 w 后檢測各組大鼠FST 不動時間。

1.5.2 糖水消耗實驗(Sucrose consumption test，SCT) 大鼠禁食、禁水24 h 后，將大鼠的飲水瓶內加入10 g/L 蔗糖溶液足量，計算24 h 內飲用蔗糖溶液的質量。于造模前、造模后和治療4 w 后檢測各組大鼠糖水消耗量。

1.6 腦勻漿液5-HT、DA、NE 的檢測 通過UPLC-FLR(超高壓液相色譜-熒光檢測器)檢測各組大鼠腦勻漿液內5-HT、DA、NE 的量，通過蛋白試劑盒(BCA protein assay kits)檢測各組大鼠腦勻漿液可溶性蛋白含量(Pr)作為內標。然后記錄每只大鼠腦內單胺類神經遞質的含量和Pr 的比值作為組間對照，反應各組間神經遞質含量的差異。

1.6.1 樣本采集及處理 治療4 w 后將大鼠用水合氯醛全麻后取腦，腦組織放在盛有PBS 液的培養皿中，小心剔除腦表面的血管及腦膜，稱量后置于離心管中加入PBS 液(腦組織∶PBS 液=1 g∶10 ml)超聲勻漿，低溫離心10 min(10 000 r/min，4 ℃)，將所得上清液再離心1 次，保存于-80 ℃冰箱中備用。樣品在進樣前先低溫解凍，再加入等體積5%高氯酸，放置20 min，低溫離心15 min(14000 r/min，4 ℃)，上清液用來進樣分析。

1.6.2 色譜條件和熒光檢測參數 色譜柱為C18 柱(BEHC 18 1.7 μm 2.1×1000 mm)，參閱文獻［6］及考察效果后，NE、DA 的分離條件流動相選用檸檬酸鈉-乙酸鈉緩沖液(50 mmol/L 檸檬酸、50 mmol/L 乙酸鈉、0.5 mmol/L 1-庚烷磺酸鈉、5 mmol/L 三乙胺、0.5 mmol/L Na2EDTA)-甲醇(90∶10，v/v)(pH=3.8)，流速為0.3 mmol/L;進樣量5 μl;熒光激發波長為280 nm，發射波長為330 nm。5-HT 的分離流動相選用0.1 mol/L KH2PO4-甲醇(80∶20，v/v)(pH=4.3)，流速為0.3 ml/min;進樣量5 μl;熒光激發波長278 nm，發射波長338 nm。

1.6.3 標準儲備液的制備 精確稱量5-HT、DA、NE 標準品，分別置于10 ml 容量瓶中，加入標準品溶劑(0.5 mmol/L Na2EDTA、0.1 g/L L-半胱氨酸、0.01 mmol/L 高氯酸的混合水溶液)，充分搖勻后配置成0.1 mg/ml 的標準儲備液，置于4 ℃冰箱保存，使用時將標準儲備液逐級稀釋至所需濃度。

1.6.4 標準曲線方程的繪制 參閱文獻［6］，精密稱量5-HT、DA、NE 標準品，將其定量混合，用標準品溶液稀釋，得到一系列質量濃度不同的溶液。用0.22 μm 濾膜過濾后按1.6.2 節的色譜條件進樣分析。以進樣質量濃度X(μg/L)對峰面積Y 作圖，繪制標準曲線。

2 結果

2.1 大鼠糖水消耗實驗結果 與造模前相比，造模后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠糖水消耗量顯著減低(P＜0.05)，Ⅴ組無顯著差異(P＞0.05)。與造模后相比，干預4 w 后Ⅰ組、Ⅱ組大鼠糖水消耗量顯著增加(P＜0.05)，Ⅲ組，Ⅳ組、Ⅴ組未見顯著性差異(P＞0.05)(見圖1)。

2.2 大鼠強迫游泳不動時間結果 與造模前相比，造模后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠強迫游泳不動時間顯著增加(P＜0.05)，Ⅴ組無顯著差異(P＞0.05)。與造模后相比，干預4 w 后Ⅰ組、Ⅱ組大鼠強迫游泳不動時間顯著降低(P＜0.05)，Ⅲ組，Ⅳ組、Ⅴ組未見顯著性差異(P＞0.05)(見圖2)。

圖1 各時間點大鼠糖水消耗量

圖2 各時間點大鼠強迫游泳不動時間

2.3 內標蛋白量 見表1。

表1 大鼠腦勻漿液蛋白量(Pr)(±s)

表1 大鼠腦勻漿液蛋白量(Pr)(±s)

2.4 5-HT、NE、DA 標準方程和色譜圖 標準曲線方程見表2。5-HT 標準品色譜圖見圖3A1，腦勻漿液5-HT 色譜圖見圖3A2;DA、NE 標準品色譜圖見圖3B1，腦勻漿液5-HT 色譜圖見圖3B2。

2.5 腦勻漿液5-HT、DA、NE 與Pr 的比值圖4A 可見:與Ⅲ組比較，Ⅰ組和Ⅱ組大鼠腦勻漿液內5-HT/Pr 顯著升高(P＜0.05)，圖4B 可見:與Ⅲ組比較，Ⅰ組大鼠腦勻漿液DA/Pr 顯著升高(P＜0.05)，而Ⅱ組未見顯著性差異(P＞0.05)。圖4C可見:與Ⅲ組比較，Ⅰ組和Ⅱ組大鼠腦勻漿液NE/Pr未見顯著差異(P＞0.05)。圖4D、圖4E、圖4F 可見:與Ⅴ組比較，Ⅳ組大鼠腦勻漿液5-HT/Pr、DA/Pr、NE/Pr 均顯著下降(P＜0.05)。

圖3 標準品及樣本5-HT、DA、NE 色譜圖

圖4 各組大鼠腦勻漿5-HT/Pr、DA/Pr、NE/Pr 的值

表2 5-HT、NE、DA 的回歸方程、線性范圍及相關系數

3 討論

嗅質(odorant)除了傳到皮質產生嗅覺外，還可以傳至鄰近腦區，參與情緒活動。嗅覺系統形態學上可以被劃分為嗅上皮(olfactory epithelium)，嗅球(olfactory bulb)和嗅皮質(olfactory cortex)3 部分。Axel 揭示了嗅覺的工作原理［7］，嗅質與鼻腔內嗅上皮特異性的嗅感受神經元(olfactory receptor neurons，ORNs)結合后引發嗅覺感受器電位，沿著嗅感覺神經元軸突傳遞至嗅球，信息在嗅球內加工修飾，形成時間和空間編碼。編碼后的信息傳遞到嗅皮質進行解碼從而表達。嗅皮質為嗅覺系統的二級嗅覺中樞。嗅皮質主要包括了AON、嗅結節(olfactory tubercle，OT)、梨狀皮質(piriform cortex)、內嗅皮質(entorhinal cortex)、杏仁體周圍區等。

嗅覺與大腦的邊緣系統的聯系是最直接的，形態學和電生理的研究發現嗅覺系統與杏仁體、海馬、下丘腦之間有廣泛的纖維聯系［8，9］;fMRI 的研究結果表明氣味刺激可以激活大腦額葉和顳葉區［10］;PET-CT 的研究顯示氣味物質在額葉內側邊緣系統、眶額葉皮質等區域引起明顯活化。嗅覺和情緒系統的加工在在解剖位置上高度重疊，嗅覺的中樞結構杏仁核、海馬、眶額皮質和島葉也是情感中樞的主要結構。本實驗室以往的研究發現丁香酚精油的吸嗅可以改善小鼠抑郁樣行為，并且在小鼠嗅球、杏仁核、海馬、下丘腦等部位可以快速地記錄到丁香酚所誘發的特征性生物電變化［11］，研究還發現薰衣草的吸嗅可以改善小鼠抑郁樣行為，并使小鼠杏仁核、海馬、下丘腦內5-HT 表達明顯增加［12］。

MDD 的發病機制是多方面的，經典的單胺能遞質理論認為MDD 發病是由于突觸間隙單胺類神經遞質異常減少引起，臨床上也主要通過提高突觸間隙5-HT 水平達到抗抑郁作用。DA 的降低導致嗜睡、興趣下降、以及厭食等，抑郁發生率增加，抗DA藥物傾向致抑郁，擬DA 藥物傾向抗抑郁［13］。情感性精神障礙的DA 理論認為，DA 能神經傳遞缺乏可能在MDD 的癥狀中起主要作用。抑郁癥與多巴胺受體及轉運體基因之間的聯系也是近期研究的熱點［14］。抑郁的發病機制也涉及NE 系統的失調。中樞NE 的活動既能產生促抑郁又有抗抑郁效應，這種矛盾取決于應激是否能預測以及急性還是慢性。此外，NE 與5-HT 能神經元之間存在相互作用，這兩種神經元系統之間相互作用及對其他腦區的調控是抗抑郁藥起效時間及效果差異的機制。

綜上所述，香蘭素吸嗅4 w 可以改善CUMS 導致的大鼠抑郁樣行為，其療效類似于氟西汀的療效，而對OBX 導致的抑郁無效。其機制可能是經嗅覺通路提高腦內5-HT、DA 水平所實現的。吸嗅的給藥途徑較臨床其他抗抑郁藥方便，且無需經過肝、腎代謝從而造成肝、腎功能的損害。香蘭素抗抑郁作用機制仍需進一步研究，其療效還需得到更多臨床試驗的證實。

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