經皮三叉神經慢性電刺激對癲癇大鼠的癲癇行為和海馬炎性反應抑制作用

王倩倩，賀慧艷，左 健，何龍泉，王 玉

癲癇是一種常見的神經系統疾病，其中約有30%～40% 的癲癇為藥物難以控制的頑固性癲癇［2］，大多數患者因各種原因而不能通過手術治療，因此，探尋新的有效治療方法一直是癲癇研究的方向之一。癲癇和偏頭痛在發病機制上有著密切的關系，二者在某種程度上均系皮質興奮性增高性疾病［3，4］，而三叉神經刺激在偏頭痛預防治療上已得到有效應用［5，6］。因此，三叉神經電刺激可能對癲癇也同樣有預防治療作用，這在少數臨床研究中已得到驗證［7］。本研究小組的前期研究證實了在實驗性癲癇誘發前予以經皮三叉神經電刺激預處理可能通過增高谷氨酸脫羧酶(GAD)而起到抗癲癇作用［8］。本研究將探討實驗性癲癇引發后予以經皮三叉神經電刺激，以期了解其在慢性癲癇形成中的干預治療作用，同時通過觀察其對炎性因子和小膠質細胞的影響探討其可能的炎性免疫機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用8～12 周齡200～250 g清潔健康雄性SD 大鼠120 只，普通級，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。置于動物實驗中心飼養1 w，以適應環境，保持室溫26±2 ℃，晝夜12/12 h交替，自由出入獲取食物和水。

1.2 試劑與儀器 經皮電刺激儀(KD-2A 型)購自北京博洋生物器械有限公司;匹羅卡品(pilocarpine)購自美國Sigma 公司;IbaⅠ標志物的小膠質細胞抗體購自日本公司;鼠IL-1β 和TNF-α 預包被ELISA 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，免疫組化二抗試劑盒購于北京博奧森生物技術公司;免疫組化二抗試劑盒以及DAB 顯色劑購自北京中杉生物技術有限公司。

1.3 實驗設計 120 只大鼠適應性飼養1 w后，隨機分成正常對照組30 只和實驗組90 只。給予實驗組大鼠匹羅卡品腹腔注射(380 mg/kg，sigma)誘發癲癇發作至持續狀態(SE)，致癇前30 min皮下注射甲基-東莨菪堿(1 mg/kg，sigma)以拮抗匹羅卡品膽堿能反應。大鼠行為學觀察根據我們修改自Racine5 級評價標準［9］:Ⅰ級:出現面部抽搐、鼻毛抽動、前爪抓耳及咀嚼動作;Ⅱ級:出現點頭運動，一側前肢陣攣;Ⅲ級:出現肢陣攣和輕微的身體抽搐;Ⅳ級:肢體陣攣、甩尾、牙關緊閉、全身抽搐;Ⅴ級:全身陣攣，失去平衡跌倒并全身僵直。III 級或III 級以上行為重復出現者界定為SE 發作。SE 后30 min，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發作。死亡率被統計于癲癇持續狀態后6 h，共12 只大鼠死于SE，死亡率約13.3%。將SE 中存活的78 只大鼠隨機分成單純匹羅卡品模型組(pilo 組，n=40 只)和經皮三叉神經電刺激組(TNS 組，n=38 只)。

模型建立后2 d 給予實驗組動物經皮三叉神經電刺激處理(TNS 組)。操作時動作輕柔，大鼠先腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉動物。TNS組大鼠俯臥固定，將兩個模式電極對稱外置于眼眶上方約1 cm 中內1/3 處的三叉神經眼支分布區域，固定后外接經皮神經電刺激儀。刺激參數［8］:頻率140 Hz、電流10 mA、脈寬0.5 ms、正向脈沖刺激1 min間歇4 min，每天連續刺激60 min。正常對照組和pilo 組實驗動物固定后，外接電刺激儀，刺激參數均設置為0，持續60 min。各組操作均在8:00～12:00間進行。

為觀察三叉神經電刺激對癲癇大鼠癲癇行為和腦內炎性反應的影響，我們采用本小組以往的再次藥物誘發癲癇的方法［10］，即實驗組各亞組動物進行4 w 的電刺激或假刺激后，再次給予匹羅卡品腹腔注射(320 mg/kg，sigma)致癇，匹羅卡品注射前30 min給予甲基-東莨菪堿(1 mg/kg，sigma)以拮抗匹羅卡品的膽堿能效應。按照前述的癲癇發作分級評價標準進行大鼠行為學觀察，比較Pilot 組和TNS組在發作強度、持續時間及6 h 死亡率。

1.4 取材與組織處理 將各組實驗大鼠分別在第二次誘發癲癇發作后的24 h、48 h、72 h、7 d、14 d、28 d 以10%水合氯醛(3.5 ml/kg，腹腔注射)麻醉，迅速斷頭取腦，冰盤內將腦組織沿矢狀縫對切成兩半，右邊腦組織迅速離斷，取出海馬組織、稱重后存入-80 ℃冰箱中，以備Elisa 定量檢測細胞因子;左邊腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，進行組織脫水，石蠟包埋制成石蠟切片。

1.5 Elisa 定量檢測細胞因子 待標本采集完畢，將標本從-80 ℃冰箱中取出，按照固定倍數加入生理鹽水勻漿，勻漿充分后移入離心管，在4 ℃以3000 r/min 離心20 min，離心后取上清液按待檢樣品分裝后，仍放入-80 ℃冰箱保存，全部操作均在低溫條件下完成。Elisa 法檢測樣本中的IL-1β、TNF-α 的含量，具體方法按照說明書進行，配置標準品、設空白孔、加樣、洗板、加檢測抗體、洗板、加酶、洗板、顯色、終止反應，反應終止10 min 讀OD450值，通過Curve Expert 1.3 分析軟件繪制標準曲線:由標準方程求出各組樣品中IL-1β、TNF-α 的含量。

1.6 免疫組化反應 切片常規脫蠟至水，抗原修復待自然冷卻后，依次加入3% H2O2、10% BSA封閉，之后加入小膠質細胞抗體(Iba Ⅰ抗體1∶1000)，4 ℃冰箱過夜后滴加二抗工作液及辣根酶，DAB 顯色、蘇木精復染清洗后沖洗干凈，烤干后中性樹膠封片。陰性對照用PBS 代替一抗。圖像采集在日本Olympus 公司提供的共聚焦顯微鏡下完成，采用同一曝光度分別對每張切片的海馬CA1、CA3、DG 區進行拍照。

2 結果

2.1 TNS 組和pilo 組大鼠癇性發作程度比較經過4 w 的三叉神經電刺激后，再次匹羅卡品致癇，pilo 組5 只大鼠(標準死亡率=1.39＞1)、TNS組2 只大鼠(標準死亡率=0.59＜1)在發作中死亡，差異有統計學意義。再次匹羅卡品致癇后TNS組大鼠較pilo 組發作程度較輕，持續時間較短(TNS 組平均分為1.8±0.4 分，持續時間13.2±5.2 min，pilo 平均分為3.5±0.9 分，持續時間26.4±5.8 min)，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)(見表1)。

表1 兩組大鼠癇性發作程度比較

2.2 海馬IL-1β 和TNF-α 蛋白含量比較 正常對照組大鼠海馬IL-1β、TNF-α 蛋白含量甚微，癲癇發作后24 h 即可檢測出海馬IL-1β 和TNF-α 含量顯著升高，至72 h 達高峰，至癲癇發作后28 d 仍可檢測出較正常對照組顯著增高(P＜0.05，P＜0.01)。TNS 組的IL-1β 和TNF-α 含量變化與Pilo 組基本一致，在癲癇發作后的24 h、48 h、72 h、7 d、14 d、28 d等各時間點TNS 組大鼠海馬IL-1β 和TNF-α 含量較正常對照組仍顯著增高但較pilo 組均顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)(見圖1、圖2)。

圖1 各時間點IL-1β 的平均濃度

圖2 各時間點TNF-α 的平均濃度

2.3 小膠質細胞活化情況比較 對照組大鼠海馬Iba1 陽性細胞表達較少，胞體呈圓形或橢圓形，突起較少。Pilo 組和TNS 組陽性細胞著色較深，部分細胞胞體演變成狹長狀及梭狀，突起增多、增粗，以致癇后7 d 最為明顯(見圖3、圖4)。Pilo 組隨癲癇發作后各時間點的延長，呈快速增加趨勢(P＜0.01)，TNS 組的變化趨勢與Pilo 組相一致(P＜0.05，P＜0.01)。TNS 組與Pilo 組比較，TNS 組活化的小膠質細胞的較pilo 組在各時間點均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)(見表2)。

表2 CA1區小膠質細胞活化數量

3 討論

一次癲癇持續狀態(SE)后腦內發生一系列的可塑性改變而致腦興奮性增高，最終均可發展成為具有自發性反復發作特點的慢性癲癇［11］。而在一次SE 后予以盡早的干預有可能改變這一發展過程從而起到減少癲癇發作的作用。本實驗中大鼠致SE 后予以經皮三叉神經電刺激處理4 w，此段時間正是慢性癲癇的形成過程。我們發現與未經三叉神經電刺激的癲癇大鼠相比再次誘發癲癇發作的強度較輕，持續時間較短，死亡率降低。提示慢性三叉神經電刺激對癲癇形成過程中腦興奮性易感性的形成有干預作用，提高了癲癇發作閾值，即降低了腦興奮性易感性。有研究表明三叉神經刺激可激活軀體感覺皮質和島葉皮質的廣泛區域［12］，因此我們推測三叉神經電刺激所致的長期慢性皮質激活可能使皮質產生一系列興奮性適應性改變，從而提高了皮質興奮性閾值。這與培養腦片予以NMDA 受體阻斷劑慢性阻斷神經元電活動后反而更易記錄到癲癇樣放電的結果相一致［13，14］。

越來越多的證據表明中樞神經系統的炎性反應參與了慢性癲癇的形成過程［15］。其中促炎因子IL-1β 和TNF-α 在癲癇形成中的作用有較多的研究。SE 或癲癇發作后腦內IL-1β 和TNF-α 含量迅速升高且維持較長時間［16］，頑固性癲癇患者腦皮質中IL-1β 含量顯著增高［1］。而以藥物減少IL-1β 合成或者阻斷與其受體結合后能夠抑制急性癲癇發作甚至減少慢性癲癇反復發作［17］，新近研究更發現這種以藥物減少IL-1β 合成還可以干擾慢性癲癇的形成［18］。外源性促炎因子TNF-α 同樣有促進癲癇放電的作用［19］，而阻斷內源性TNF-α 與其受體的結合則抑制癲癇敏感性和相應的病理改變［20］。本實驗發現癲癇大鼠經匹羅卡品再次誘發癲癇發作后腦內IL-1β 和TNF-α 含量較正常大鼠顯著增高且維持近4 w 的較長時間增高，而三叉神經電刺激干預處理后則各時間點IL-1β 和TNF-α 含量均較未干預組顯著下降。提示三叉神經電刺激的抗癲癇作用可能與其降低炎性因子IL-1β 和TNF-α 的表達有關。腦內炎性因子主要產生于小膠質細胞和星形膠質細胞，我們進一步觀察了三叉神經電刺激慢性干預后癲癇大鼠再次誘導癲癇發作所引起的海馬小膠質細胞反應情況。結果發現三叉神經電刺激處理后癲癇發作活化的小膠質細胞數較未經三叉神經電刺激處理的活化的小膠質細胞數顯著減少。提示三叉神經電刺激的抗癲癇作用可能與其降低小膠質細胞活化有關。活化的小膠質細胞可通過產生的促炎細胞因子介導神經元的興奮性改變參與癲癇的形成過程［21］。結合三叉神經電刺激大鼠促炎因子IL-1β 和TNF-α的表達減少，我們推測三叉神經電刺激可能通過抑制小膠質細胞的激活進而減少IL-1β 和TNF-α 的表達而起到抑制癲癇發作的作用［22］。當然，經由小膠質細胞的其它機制也可能參與了三叉神經電刺激的抗癲癇作用，如激活的小膠質細胞通過釋放對慢性癲癇形成有重要影響的腦源性神經生長因子(BDNF)參與癲癇腦興奮性的改變［23］。本研究主要集中于炎性機制的探討，三叉神經在腦內的解剖聯系遠較單純的感覺傳導要復雜的多。三叉神經有分支纖維到達蘭斑核，而刺激蘭斑核則有顯著的抑制驚厥發作的作用［24］，毀損蘭斑核則可促進慢性癲癇的形成［25］或加重癲癇的自發性反復發作［26］，因此本研究的三叉神經電刺激治療抗癲癇作用也不能排除與經由蘭斑核的信號傳導有關。

綜上，大鼠一次SE 后的慢性癲癇形成過程中，予以經皮三叉神經慢性電刺激處理提高了大鼠再次癲癇發作的閾值，其機制可能與其減輕海馬炎性反應有關。關于三叉神經慢性電刺激對SE 后的長期自發性癲癇反復發作的效應尚在進一步觀察中。

圖3 24 h 和48 h 海馬CA1區小膠質細胞活化情況(A2-D2 系A1-D1 的相應放大圖像)

圖4 72 h 和7 d 海馬CA1區小膠質細胞活化情況(A2-D2 系A1-D1 的相應放大圖像)

［1］Choi J，Nordli DR，Alden TD，et al.Cellular injury and neuroinflammation in children with chronic intractable epilepsy［J］.J Neuroinflammation，2009，6:38.

［2］Kwan P，Brodie MJ.Early identification of refractory epilepsy［J］.N Engl J Med，2000，342(5):314-319.

［3］黃 琳，王 玉.偏頭痛與癲癇關系的最新進展［J］.中華臨床醫師雜志，2011，5(16):123-126.

［4］李 娜，何龍泉，王 玉.非先兆性偏頭痛與慢性偏頭痛發作間期皮層興奮性改變的視覺誘發電位研究［J］.中華臨床醫師雜志，2013，7(2):649-652.

［5］Simopoulos T，Bajwa Z，Lantz G，et al.Implanted auriculotemporal nerve stimulator for the treatment of refractory chronic migraine［J］.Headache，2010，50(6):1064-1069.

［6］Reed KL，Black SB，Banta CJ，et al.Combined occipital and supraorbital neurostimulation for the treatment of chronic migraine headaches:initial experience［J］.Cephalalgia，2010，30(3):260-271.

［7］DeGiorgio CM，Murray D，Markovic D，et al.Trigeminal nerve stimulation for epilepsy:long-term feasibility and efficacy［J］.Neurology，2009，72(10):936-938.

［8］張慧敏，李良勇，李家林，等.經皮三叉神經電刺激預處理對戊四氮致癇大鼠海馬谷氨酸脫羧酶表達的影響［J］.安徽醫科大學學報，2011，46(8):732-736.

［9］Li LY，Li JL，Zhang HM，et al.Treatment reduces hippocampal damage，spontaneous recurrent seizures，and learning memory deficits in pilocarpine-treated rats［J］.J Mol Neurosci，2012，50(1):109-123.

［10］Wang Y，Liu PP，Li LY，et al.Hypothermia reduces brain edema，spontaneous recurrent seizure attack，and learning memory deficits in the kainic acid treated rats［J］.CNS neuroscience ＆ therapeutics，2011，17(5):271-280.

［11］Navarro Mora G，Bramanti P，Osculati F，et al.Does pilocarpine-induced epilepsy in adult rats require status epilepticus［J］?PloS one，2009，4(6):e5759.

［12］Lotsch J，Walter C，Felden L，et al.The human operculo-insular cortex is pain-preferentially but not pain-exclusively activated by trigeminal and olfactory stimuli［J］.PloS one，2012，7(4):e34798.

［13］Wang XM，Bausch SB.Effects of distinct classes of N-methyl-D-aspartate receptor antagonists on seizures，axonal sprouting and neuronal loss in vitro:suppression by NR2B-selective antagonists［J］.Neuropharmacology，2004，47(7):1008-1020.

［14］He S，Shao LR，Wang Y，et al.Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition［J］.Journal of Neurophysiology，2013，109(6):1535-1547.

［15］D’Ambrosio R，Eastman CL，Fattore C，et al.ovel frontiers in epilepsy treatments:preventing epileptogenesis by targeting inflammation［J］.Expert Review of Neurotherapeutics，2013，13(6):615-625.

［16］Pernot F，Heinrich C，Barbier L，et al.Inflammatory changes during epileptogenesis and spontaneous seizures in a mouse model of mesiotemporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2012，52(12):2315-2325.

［17］Maroso M，Balosso S，Ravizza T，et al.Interleukin-1beta biosynthesis inhibition reduces acute seizures and drug resistant chronic epileptic activity in mice［J］.Neurotherapeutics，2011，8(2):304-315.

［18］Ravizza T，Noe F，Zardoni D，et al.Interleukin Converting Enzyme inhibition impairs kindling epileptogenesis in rats by blocking astrocytic IL-1beta production［J］.Neurobiology of dDisease，2008，31(3):327-333.

［19］Shandra AA，Godlevsky LS，Vastyanov RS，et al.The role of TNFalpha in amygdala kindled rats［J］.Neurosci Res，2002，42(2):147-153.

［20］Weinberg MS，Blake BL，McCown TJ.Opposing actions of hippocampus TNFalpha receptors on limbic seizure susceptibility［J］.Experimental Neurology，2013，247:429-437.

［21］Devinsky O，Vezzani A，Najjar S，et al.Glia and epilepsy:excitability and inflammation［J］.Trends Neurosci，2013，36(3):174-184.

［22］Zheng H，Zhu W，Zhao H，et al.Kainic acid-activated microglia mediate increased excitability of rat hippocampal neurons in vitro and in vivo:crucial role of interleukin-1beta［J］.Neuroimmunomodulation，2010，17(1):31-38.

［23］Ferrini F，De Koninck Y.Microglia Control Neuronal Network Excitability via BDNF Signalling［J］.Neural plasticity，2013，2013:429815.

［24］Jimenez-Rivera C，Voltura A，Weiss GK.Effect of locus ceruleus stimulation on the development of kindled seizures［J］.Experimental neurology，1987，95(1):13-20.

［25］Corcoran ME，Mason ST.Role of forebrain catecholamines in amygdaloid kindling［J］.Brain research，1980，190(2):473-484.

［26］Giorgi FS，Ferrucci M，Lazzeri G，et al.A damage to locus coeruleus neurons converts sporadic seizures into self-sustaining limbic status epilepticus［J］.The European Journal of Neuroscience，2003，17(12):2593-2601.