APOE ε4 等位基因與尿AD7c-NTP 聯合檢測在AD 早期診斷中的初步研究

鄭 磊，魏 琰，張鳳春，張金榮，劉紅梅

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種嚴重的神經退行性疾病，臨床上以記憶損失和認知功能下降為主，是老年癡呆的常見形式，極大的威脅老年人的生命及健康［1］。目前，AD 的診斷主要依據患者臨床表現并結合電子計算機X 射線斷層掃描技術，核磁共振及神經心理學量表等綜合評價。然而，由于AD 的潛伏期較長，從癥狀出現到確診一般要3 y 左右時間，且在AD 確診時患者多已存在明顯的神經元損害，而此時進行藥物干預治療的效果有限［2］。因此，探尋準確特異的生物標記物早期鑒別診斷AD易發(fā)人群，實現AD 早發(fā)現早治療的目標已勢在必行。本研究對APOE ε4 等位基因與尿AD7c-NTP 聯合檢測在AD 早期診斷中預測效果及臨床意義進行探討，以期為AD 易發(fā)人群鑒別及早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 所有研究對象均來自2012 年6 月～2013 年9 月我院神經內科收治患者202 例。入組標準:(1)符合中國精神障礙分類與診斷標準第三版(CCMD-3)有關精神分裂癥及輕度阿爾茨海默病的診斷標準，由2 名副高職稱以上的神經科醫(yī)師明確診斷;(2)按照簡易智能狀態(tài)量表(mini mental state examination，MMSE)評分標準，臨床診斷為認知功能正常者MMSE 評分均大于等于27 分，臨床診斷疑似AD 患者MMSE 評分均小于等于17 分;(3)入組前無明顯的抑郁癥狀，其漢密爾頓抑郁量表(hamilton depression scale，HAMD)評分均不少于14 分。排除標準:(1)長期大量服用抗精神病藥物和曾有嚴重頭部外傷史;(2)患者累及中樞神經系統功能的內科疾病;(3)患有嚴重精神疾病患者;(4)認知功能檢查過程不能配合的患者。按照以上標準，共收集認知功能正常者90 例(對照組，90 例，平均年齡70.4±8.2 歲，MMSE=29.7±1.4)，臨床診斷疑似AD 患者76 例(PAD 組，76 例，平均年齡72.2±9.2 歲，MMSE=16.2±2.6)，各組在年齡，性別，教育年限方面差異無顯著性(P≥0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對象空腹抽取靜脈血10 ml，采用肝素鋰抗凝保存，常溫保存時間不多于24 h，晨尿30～50 ml，4 ℃保存時間不多于7 d。

1.2.2 儀器與試劑 酶標儀購自Thermo Fisher Scientific 公司，型號為MultiSkan FC;臺式低溫離心機購自Eppendorf 公司，型號為5810R;PCR 儀購自Bio-Rad 公司，型號為MyCycler;瓊脂糖凝膠電泳儀購自北京六一公司，型號DYCP-31DN;核酸蛋白測定儀購自Eppendorf 公司，型號為BioPhotometer D30;

1.2.3 限制性內切酶基因亞型分型 利用Hixson 和Vernier 等［3］的PCR 及限制性內切 酶APOE 基因亞型分型方法，通過紅細胞裂解液分離靜脈血樣本(10 ml)中的白細胞，白細胞經預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后，提取基因組DNA 進行基因擴增，擴增引物為F4(5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)和F6(5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’)，擴增產物經HhaI 酶切(酶切位點為GCGC)后進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳后分離條帶的位置及數量區(qū)分不同的APOE 等位基因亞型。

1.2.4 酶聯免疫吸附檢測 尿AD7c-NTP 酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自深圳市安群生物工程有限公司，嚴格按試劑說明書操作。

1.2.5 統計分析 采用SPSS17.0 統計軟件對數據進行統計分析處理。符合正態(tài)分布的計量資料采用±s 表示，兩組間差異比較采用t 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APOE 等位基因在對照組、PAD 組中表達頻率的比較 為確定APOE 等位基因是否在對照組和PAD 組中存在不同的表達頻率，本研究利用Hixson 和Vernier 等［3］的PCR 及限制性內切酶APOE基因亞型分型方法，對所有166 例患者進行APOE等位基因的檢測，結果顯示PAD 組APOE ε4 等位基因較對照組的表達頻率顯著提高(P≤0.05)(見表1)，而APOE ε2 或ε3 等位基因對照組和PAD 組間中表達頻率無差異(P≥0.05)(見表1)，提示，APOE ε4 等位基因可能與AD 的發(fā)生相關。

2.2 酶聯免疫吸附檢測對照組、PAD 組尿樣中AD7c-NTP 的含量 酶聯免疫吸附結果顯示，尿樣中AD7c-NTP 的含量在PAD 組中較對照組有顯著升高(P≤0.01)(見表3)，提示尿樣中AD7c-NTP 的含量變化與AD 相關。

2.3 APOE ε4 與AD7c-NTP 聯合診斷與單獨診斷比較 作為有效的AD 早期診斷的生物標記物，其必須擁有較高的靈敏度、特異性、陽性預測值和陰性預測值。本研究對PAD 組中34 例APOE ε4等位基因陽性患者及對照組中71 例APOE ε4 等位基因陰性患者進行尿AD7c-NTP 檢測(見表3)。結果顯示，相比與單獨檢測，尿AD7c-NTP 在攜帶APOE ε4 等位基因的患者中的檢測效果高于單獨檢測，提示APOE ε4 與AD7c-NTP 聯合檢測在AD 早期診斷中具有較好的預測價值。

表1 APOE 等位基因在對照組、PAD 組中表達頻率的比較

表2 酶聯免疫吸附檢測比較對照組、PAD 組尿樣中AD7c-NTP 的含量(±s，ng/ml)

表2 酶聯免疫吸附檢測比較對照組、PAD 組尿樣中AD7c-NTP 的含量(±s，ng/ml)

表3 對照組和PAD 組中APOE ε4 與AD7c-NTP 聯合檢測比較

表4 APOE ε4 與AD7c-NTP 聯合診斷與單獨診斷效果比較

3 討論

據統計，全球65 歲以上老人有13%發(fā)生AD，而85 歲以上老人AD 患病率高達45%，隨著人口老齡化的加速，預計到2050 年，全世界將有8000 萬人遭受AD 困擾［4］。目前，由于AD 病因及發(fā)病機制尚未闡明，治療方法主要通過降低AD 的特征性病理特征如β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)寡聚合物、淀粉樣斑塊(amyloid plaques)、微管相關蛋白tau 聚合物和神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)等，以期阻止疾病進展［5，6］。這種“減少毒素”的治療策略在AD 發(fā)生的早期可以取得較好效果，但在AD 病程的中后期僅能緩解AD 的癥狀，無法遏制或逆轉AD 的病程［7］。因此，探尋準確特異的生物標記物早期診斷鑒別AD 易發(fā)人群，監(jiān)測病程進展和藥物療效，以實現AD 早發(fā)現早治療的目標已勢在必行。

近期，全基因組關聯研究證實，載脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)基因多態(tài)性與AD 發(fā)病風險關系密切，其APOE ε4 等位基因是AD 最強的遺傳危險因素，與早發(fā)性和遲發(fā)性AD 發(fā)病風險增加呈正相關［8，9］。人APOE 存在3 種主要亞型即APOE2、APOE3、APOE4，分別由19 號染色體長臂上3 個等位基因ε2、ε3、ε4 編碼產生，其全球基因頻率分別為8.4%、77.9%、13.7%，然而，APOE ε4 在AD患者中的頻率卻高達40%。已經證實，APOE ε4 以劑量相關方式增加AD 的發(fā)病率并使患者發(fā)病年齡提前，Farrer 等［10］研究發(fā)現，91%的APOE ε4 純合基因攜帶者在68 歲左右發(fā)病，約47%的APOE ε4 雜合基因攜帶者在76 歲時發(fā)病，而在APOE ε4 非攜帶者中，僅20%的人在85 歲時才發(fā)生AD。此外，在輕度認知功能障礙(Mild cognitive impairment，MCI)患者中，攜帶APOE ε4 的患者表現出更快的認知功能下降和記憶損失，而MCI 被認為是AD 的早期階段，與AD 發(fā)病風險密切相關。APOE 是人體重要的載脂蛋白，其可通過介導脂質轉運調節(jié)脂類平衡。在外周組織中，APOE 主要由肝臟和巨噬細胞產生，介導機體膽固醇代謝。已經證實，APOE4 與高血脂癥和高膽固醇血癥相關，而二者可引發(fā)動脈粥樣硬化，冠狀動脈心臟病和卒中等心腦血管病。在中樞神經系統中，APOE4 主要由星形膠質細胞產生，通過低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)和LDL 相關蛋白參與膽固醇平衡［11］。

大量研究表明，APOE 與Aβ 代謝密切相關，其基因亞型可強烈影響Aβ 沉積所形成的老年斑，并促進腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)發(fā)生，而Aβ 和CAA 正是AD 兩個最主要的病理特征。免疫組化證據表明，APOE 與AD 患者大腦中的老年斑共同沉淀，且APOE ε4 攜帶者要顯著多于非攜帶者(40.7%對8.2%)，而這種差異在50～59 歲之間最為明顯［12］。Barthel 等［13］利用匹茲堡化合物B(pittsburgh compound B，PiB)PET 成像技術證實，APOE ε4 基因攜帶者在PiBPET 陽性AD 患者中的比率顯著高于PiBPET 陰性患者(65%對22%)，提示APOE ε4 基因攜帶者擁有較多的纖維狀Aβ 聚集，原因可能與APOE 參與調節(jié)大腦Aβ 代謝、聚集和沉積有關。已經證實，大腦Aβ 水平和淀粉樣斑塊的形成為APOE 亞型依賴(ε4＞ε3＞ε2)［14］。基礎研究發(fā)現，APOE 調節(jié)Aβ 的清除主要是將大腦中Aβ 通過血腦屏障運輸到外周血液循環(huán)，而APOE4對Aβ 的運輸能力和清除效率顯著低于APOE3，可能與APOE4-脂蛋白與Aβ 的親和力低于APOE3-脂蛋白相關［15］。此外，APOE 亞型對大腦膽固醇水平的調節(jié)不同，而膽固醇可調節(jié)γ-分泌酶活性和Aβ的產生，相比于APOE4，APOE3 可更有效的促進酶介導的Aβ 降解［16］。最近，許多研究發(fā)現，APOE 等位基因亞型可影響大腦及腦脊液中APOE 的水平(ε4＜ε3＜ε2)，認為APOE ε4 基因攜帶者所引起的總APOE 水平的降低可能有助于AD 疾病的進展［17］。此外，APOE 還與AD 其他的風險因子密切相關，已經證實，APOE ε4 可通過與動脈粥樣硬化，周圍血管疾病及2 型糖尿病等協同作用增加AD 的發(fā)病風險。最近，Yang 等［18］亦證實，APOE 與成人海馬齒狀回區(qū)域的神經干細胞或祖細胞的維護密切相關，而APOE ε4 可通過損傷海馬區(qū)γ-氨基丁酸(GABA)能中間神經元抑制海馬神經發(fā)生，從而導致記憶和學習障礙，揭示APOE4 的一個重要病理作用，即通過抑制或減少神經發(fā)生促進AD 疾病的進展［2］。已經證實，APOE 的表達受核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)和肝臟X 受體(liver X receptors)與維甲酸X 受體(retinoid X receptors，RXRs)協調作用影響。Cramer 等［19］證實，在患有AD 的嚙齒類動物中，口服RXRs 激動劑蓓薩羅丁(bexarotene)可提高APOE 的表達，并顯著增強APOE 基因依賴的Aβ 的清除，其72 h 內可將小鼠腦內沉積的Aβ 清除半數，最終的總清除率可達75%，提示將APOE 作為AD 檢測和治療靶點的具有廣闊前景。免疫治療作為AD 的治療策略亦取得一定成果，如近期靶向于Aβ N 末端的抗體bapineuzumab，其III 期臨床試驗結果顯示，bapineuzumab 可有效阻止攜帶APOE ε4 基因的輕中度AD 患者大腦Aβ 的沉積，較低其微管相關蛋白tau 的磷酸化水平。此外，Head 等［20］研究表明，維持血管健康，積極的休閑活動和鍛煉有助于減少APOE ε4 基因攜帶者AD 的發(fā)生和認知功能下降。近年來，APOE ε4 作為AD發(fā)病的風險因子正逐漸成為探索AD 發(fā)病機制的熱點，然而基于AD 發(fā)病機制的關系仍有許多不清，尚需要大量APOE ε4 相關的研究探索工作。由于APOE 對AD 的作用還可能受LDLR 基因及膽固醇水平等因素調節(jié)，單純的以APOE ε4 等位基因預測AD 仍存在一些局限。如Itabashi 等［21］研究發(fā)現，僅通過APOE ε4 診斷AD 的敏感度和特異度不高(50%左右)，且存在一定程度的假陽性和假陰性。因此，應該指出，單獨應用APOE ε4 作為AD 診斷的生物標記物時，應首先排除影響其檢測的因素，亦或結合其他生物標記物聯合診斷，以提高其在AD 早期診斷的靈敏度和特異度。

近期大量研究發(fā)現，在早期AD 患者的腦脊液和尿液中阿爾茨海默相關神經絲蛋白(alzheimer’s disease related neural thread protein，AD7c-NTP)的表達水平都選擇性的增加。AD7c-NTP 屬神經絲蛋白家族的一個成員，是由375 個氨基酸組成的基因序列編碼產生大小為41KD 的跨膜磷酸化蛋白，大量存在于AD 患者腦中的NFTs 中，參與腦神經元的修補、再生和凋亡等［22］。AD7c-NTP 主要在組織學尚完整的變性神經元中表達增加，待神經元細胞衰亡后，大量的AD7c-NTP 被釋放到腦脊液中，后經尿液排出。de la Monte 等［23］發(fā)現，在AD 病程的早期AD7c-NTP 基因過度表達，從而引起AD7c-NTP 免疫活性的增強，進而導致磷酸化tau 蛋白免疫介導的細胞骨架病變，但AD7c-NTP 不參與淀粉樣蛋白的聚積。另外，過度表達的AD7c-NTP 還可加速凋亡介導的神經細胞死亡，促進p53 和CD95 等促凋亡基因的表達，還可引起線粒體功能受損等［24］。越來越多的證據表明，AD7c-NTP 的異常變化是AD 病程早期的生物學事件，其在腦脊液和尿液中的含量與AD疾病的嚴重程度呈正相關［25］。若腦脊液或尿液中含量異常增高，早期可疑或可能AD 占62%，死后確定診斷的AD 占84%。然而，有對腦脊液中AD7c-NTP 進行檢測有損傷大腦的風險，且需專業(yè)人員及特殊設備，使其在應用時存在一定的局限性。近期，大量的研究表明，AD 患者尿液中AD7c-NTP 的水平較正常老人顯著增加，與年齡無關。尿AD7c-NTP診斷早期AD 的特異度為90%，靈敏度為80%～85%，與腦脊液標本的檢測相比具有取材簡單、無創(chuàng)、易復查等特點，使其在AD 早期診斷上更具應用價值［26］。

本研究結果顯示，PAD 組患者APOE ε4 等位基因表達頻率較對照組顯著升高(見表1)，說明AD 發(fā)病與APOEε4 等位基因的水平相關，然而單獨應用APOE ε4 作為AD 早期診斷的生物標記物，其靈敏度和特異性僅50%左右(見表1)，提示APOE ε4 僅適于作為AD 易發(fā)人群早期基因篩查，應同時結合臨床病理檢查和/或特異的AD 生物標記物等進一步診斷及監(jiān)測。與Tan 等研究結果一致，我們的結果顯示，尿AD7c-NTP 水平在PAD 組患者中顯著高于對照組，其靈敏度為81.25，特異性高達86.67%。為評估APOE ε4 與AD7c-NTP 聯合檢測在AD 易發(fā)人群早期篩查和診斷中臨床意義，我們對APOE ε4和AD7c-NTP 聯合檢測進行比較，結果顯示，聯合檢測的靈敏度、特異性、PPV 和陰NPV 均高于單獨檢測。此外APOE ε4 和AD7c-NTP 檢測操作簡單，無創(chuàng)，可重復性高，易于患者定期監(jiān)測，提示APOE ε4與AD7c-NTP 聯合檢測在AD 早期診斷中具有較好的應用價值。

總之，我們的研究結果證實，在疑似AD 患者中，APOE ε4 等位基因的表達頻率顯著增高，而尿AD7c-NTP 的水平亦顯著升高，二者的變化與AD 疾病早期進展關系密切。通過APOE ε4 與AD7c-NTP聯合檢測可互補二者在單獨應用時的不足，提升AD診斷的預測價值，宜作為AD 易發(fā)人群篩查及早期診斷的生物標記物。

［1］Alzheimer’s Association.2012 Alzheimer’s disease facts and figures［J］.Alzheimers Dement，2012，8:131-168.

［2］Liu CC，Kanekiyo T，Xu H，et al.Apolipoprotein E and Alzheimer disease:risk，mechanisms and therapy［J］.Nat Rev Neurol，2013，9(2):106-118.

［3］Hixson JE，Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI［J］.J Lipid Res，1990，31(3):545-548.

［4］Humpel C.Identifying and validating biomarkers for Alzheimer’s disease［J］.Trends Biotechnol，2011，29(1):26-32.

［5］Mullard A.Sting of Alzheimer’s failures offset by upcoming prevention trials［J］.Nature Rev Drug Discov，2012，11(9):657-660.

［6］Herrmann N，Chau SA，Kircanski I，et al.Current and emerging drug treatment options for Alzheimer’s disease:a systematic review［J］.Drugs，2011，71:2031-2065.

［7］Lu B，Nagappan G，Guan X，et al.BDNF-based synaptic repair as a disease-modifying strategy for neurodegenerative diseases［J］.Nat Rev Neurosci，2013，14(6):401-416.

［8］Harold D，Abraham R，Hollingworth P，et al.Genome-wide association study identifies variants at CLU and PICALM associated with Alzheimer’s disease［J］.Nat Genet，2009，41(10):1088-1093.

［9］Huang Y，Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies［J］.Cell，2012，148(6):1204-1222.

［10］Farrer LA，Cupples LA，Haines JL，et al.Effects of age，sex，and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease.A meta-analysis.APOE and Alzheimer Disease Meta Analysis Consortium［J］.JAMA，1997，278(16):1349-1356.

［11］Bu G.Apolipoprotein E and its receptors in Alzheimer’s disease:pathways，pathogenesis and therapy［J］.Nat Rev Neurosci，2009，10(5):333-344.

［12］Kok E，Haikonen S，Luoto T，et al.Apolipoprotein E-dependent accumulation of Alzheimer disease-related lesions begins in middle age［J］.Ann Neurol，2009，65(6):650-657.

［13］Barthel H，Gertz HJ，Dresel S，et al.Cerebral amyloid-β PET with florbetaben(18F)in patients with Alzheimer’s disease and healthy controls:a multicentre phase 2 diagnostic study［J］.Lancet Neurol，2011，10(5):424-435.

［14］Castellano JM，Kim J，Stewart FR，et al.Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance［J］.Sci Transl Med，2011，3(89):8957.

［15］Deane R，Sagare A，Hamm K，et al.apoE isoform-specific disruption of amyloid beta peptide clearance from mouse brain［J］.J Clin Invest，2008，118(12):4002-4013.

［16］Osenkowski P，Ye W，Wang R，et al.Direct and potent regulation of gamma-secretase by its lipid microenvironment［J］.J Biol Chem，2008，283(33):22529-22540.

［17］Wahrle SE，Shah AR，Fagan AM，et al.Apolipoprotein E levels in cerebrospinal fluid and the effects of ABCA1 polymorphisms［J］.Mol Neurodegener，2007，2:7.

［18］Yang CP，Gilley JA，Zhang G，et al.ApoE is required for maintenance of the dentate gyrus neural progenitor pool［J］.Development，2011，138(20):4351-4362.

［19］Cramer PE，Cirrito JR，Wesson DW，et al.ApoE-directed therapeutics rapidly clear β-amyloid and reverse deficits in AD mouse models［J］.Science，2012，335(6075):1503-1506.

［20］Head D，Bugg JM，Goate AM，et al.Exercise Engagement as a Moderator of the Effects of APOE Genotype on Amyloid Deposition［J］.Arch Neurol，2012，69(5):636-643.

［21］ItabashiS，Arai H，Matsui T，et al.Absence of association of alpha1-antichymotrypsin polymorphisms with Alzheimer’s disease:a report on autopsy-confirmed cases［J］.Exp Neurol，1998，151(2):237-240.

［22］Levy S，McConville M，Lazaro GA，et al.Competitive ELISA studies of neural thread protein in urine in Alzheimer’s disease［J］.J Clin Lab Anal，2007，21(1):24-33.

［23］de la Monte SM，Wands JR.The AD7c-NTP neuronal thread protein biomarker for detecting Alzheimer’s disease［J］.Front Biosci，2002，7:989-996.

［24］de la Monte SM，Wands JR.Alzheimer-associated neuronal thread protein-induced apoptosis and impaired mitochondrial function in humancentral nervous system-derived neuronal cells［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2001，60(2):195-207.

［25］Youn YC，Park KW，Han SH，et al.Urine neural thread protein measurements in Alzheimer disease［J］.J Am Med Dir Assoc，2011，12(5):372-376.

［26］Levy S，McConville M，Lazaro GA，et al.Competitive ELISA studies of neural thread protein in urine in Alzheimer’s disease［J］.J Clin Lab Anal，2007，21(1):24-33.