黃連解毒湯不同組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠的影響

杜巧輝，謝曉芳，彭成，曹小玉，龔小紅，賀抒，周彥希

·藥理毒理·

黃連解毒湯不同組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠的影響

杜巧輝1,2，謝曉芳1,2，彭成1,2，曹小玉2，龔小紅1,2，賀抒1,2，周彥希1,2

目的：探討黃連解毒湯各組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠的影響。方法：采用內(nèi)毒素與角叉菜膠聯(lián)合制備大鼠熱毒血瘀模型，分別灌胃黃連解毒湯水提物、總生物堿、總黃酮和總環(huán)烯醚萜后，觀察不同組分群對(duì)熱毒血瘀模型大鼠一般狀態(tài)、血象和血液流變學(xué)的影響。結(jié)果：造模后大鼠一般狀態(tài)差，有便溏等表現(xiàn)，白細(xì)胞有升高，全血粘度、紅細(xì)胞壓積、全血低切相對(duì)指數(shù)均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；各預(yù)防給藥組可明顯改善大鼠的一般狀態(tài)，使模型大鼠的血液全血粘度、壓積明顯降低，總生物堿還能明顯降低全血高切還原粘度（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：黃連解毒湯水提物、總生物堿、總黃酮和環(huán)烯醚萜均對(duì)熱毒血瘀證大鼠具有一定治療作用，可改善其熱毒癥狀，改善血液流變性，其中總生物堿是主要活性組分群。

黃連解毒湯；熱毒血瘀；有效成分群

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，處方首載于葛洪《肘后備急方》而無(wú)方名，至唐代王燾在《外臺(tái)秘要》引崔氏方始冠以此名。本方為治療外感邪氣入里化火之實(shí)熱證的清熱解毒代表方。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖和血脂、抗腦缺血和抗腫瘤等作用[1～4]。中醫(yī)認(rèn)為熱蘊(yùn)血分容易造成血瘀，是引起血瘀證的主要病因之一。熱盛傷津耗液使血液黏稠，熱盛灼傷脈絡(luò)使血行不利，熱盛迫血妄行使血液離經(jīng)，熱盛阻遏氣機(jī)以致氣滯，這些過程均表明熱毒可致血瘀。因此，筆者認(rèn)為除抗菌、抗炎、解熱等藥理作用外[5]，黃連解毒湯清熱解毒的本質(zhì)還可能表現(xiàn)在對(duì)血液系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。因此，本文采用角叉菜膠和脂多糖聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠熱毒血瘀證模型[6]，探討黃連解毒湯對(duì)熱毒血瘀證大鼠的治療作用。

1 材料

1.1 儀器

全自動(dòng)血球儀MEK-6318K（日本光電株式會(huì)社）；分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，JA1003）；恒溫水浴鍋；凡士林等。

1.2 藥物及試劑

黃連解毒湯總生物堿，黃連解毒湯總黃酮，黃連解毒湯總環(huán)烯醚萜，黃連解毒湯水提物，含生藥量分別為90 g．g-1，80 g．g-1，50 g．g-1，5 g．g-1，均由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供。分別用蒸餾水配成6.1 g．L-1，6.9 g．L-1，11 g．L-1，110 g．L-1的混懸液保存?zhèn)溆茫话⑺酒チ峙蒡v片（Astrazeneca公司，產(chǎn)品批號(hào)：1101083）用生理鹽水配成0.02 g．mL-1；內(nèi)毒素（Escherichia coli O55:B5，Sigma公司，L8880）用生理鹽水稀釋成50 mg．L-1；角叉菜膠（Carragenan，Sigma公司，產(chǎn)品批號(hào)：1001245633）用生理鹽水配成10 g．L-1，沸水浴使之完全溶解后使用。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，全雄，體重（200±20）g， 由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)SCXK（川）2008-11。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)：TCM-2009-315，環(huán)境溫度18-22℃。

2 方法

2.1 分組及給藥

取健康、合格SPF級(jí)雄性大鼠56只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿司匹林組、總生物堿組、總黃酮組、總環(huán)烯醚萜組和水提物組，每組8只。禁食不禁水12 h后，各組開始灌胃相應(yīng)藥液，給藥劑量均為10 mL．kg-1，其中黃連解毒湯水提物和各組分群給藥量均相當(dāng)于黃連解毒湯5.5 g．kg-1；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均灌胃生理鹽水，每日1次，連續(xù)5天。

2.2 模型建立

末次給藥5 h后，除正常對(duì)照組外其余各組開始造模，即先腹腔注射角叉菜膠溶液2.5 mL．kg-1，8 h后尾靜脈注射LPS溶液1 mL．kg-1；正常對(duì)照組均注射等劑量生理鹽水。以注射LPS時(shí)為造模0 h，以尾部出現(xiàn)明顯，肉眼可見的血栓為造模成功。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

從造模開始觀察大鼠的一般狀態(tài)。造模2 h時(shí)，眼眶采血測(cè)定血常規(guī)；造模6 h后，對(duì)各組大鼠股動(dòng)脈取血測(cè)定血液流變學(xué)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包建立實(shí)驗(yàn)結(jié)數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行分析，定量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本均數(shù)的比較采用one-way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)一般情況的影響

造模后大鼠主要表現(xiàn)為：聳毛，扎堆，閉目少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，張口呼吸，精神萎靡，或有二便失禁，便溏稀，四肢癱軟無(wú)力。癥狀多在注射LPS后5～10 min出現(xiàn)，逐級(jí)加重。模型組大鼠尾部均出現(xiàn)明顯血栓，長(zhǎng)度1-15cm不等，嚴(yán)重者全尾均呈明顯黑色血栓，各給藥組大鼠在預(yù)防給藥5天后，以上癥狀有所緩解，尾部血栓出現(xiàn)時(shí)間延遲，且血栓長(zhǎng)度相對(duì)短。

3.2 對(duì)大鼠血常規(guī)的影響

由表1可見，模型大鼠在造模2 h后表現(xiàn)為WBC升高，主要以Lymph和Gran升高為主，而PLT、RBC呈下降趨勢(shì)；經(jīng)治療后阿司匹林組大鼠PLT進(jìn)一步減少（P＜0.05），但其余各組對(duì)血常規(guī)無(wú)明顯影響。

表1 黃連解毒湯各組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠血常規(guī)的影響（）

表1 黃連解毒湯各組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠血常規(guī)的影響（）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動(dòng)物（只） 劑量（g．kg-1） WBC（1×1012） RBC（1×109） HGB（g．L-1） PLT（1×109） Lymph（%） Mid（%） Gran（%）正常對(duì)照 8 — 19.52±6.84 6.98±1.40 97.36±19.70 376.55±119.18 49.55±7.89 14.83±9.49 35.57±10.42模型對(duì)照 8 — 24.75±8.39 6.30±0.71 96.36±11.25 308.09±118.35 12.86±4.08** 4.83±1.96 82.31±4.66**阿司匹林 8 0.200 22.76±5.18 7.01±0.53 105.70±6.83 172.90±117.99* 12.88±4.45 5.66±2.32 82.46±5.48總黃酮 8 0.069 24.37±6.93 6.09±0.59 87.67±8.28 299.44±96.71 11.19±2.72 5.26±2.67 83.56±4.04總生物堿 8 0.061 23.64±8.61 7.07±0.69 108.40±9.40 210.40±119.86 14.10±4.64 7.68±4.98 78.22±8.34總環(huán)烯醚萜 8 0.110 26.62±10.60 6.64±0.96 99.55±15.38 267.36±112.73 13.29±5.99 6.14±3.84 80.57±9.21水提物 8 1.100 25.10±7.73 6.28±0.96 93.50±14.46 339.33±162.92 14.97±7.71 11.88±13.45 73.16±18.66

3.3 對(duì)大鼠血液流變性的影響

由表2可見，經(jīng)造模后模型對(duì)照組大鼠全血粘度、壓積、和全血低切相對(duì)指數(shù)均明顯升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，黃連解毒湯水提液及總生堿、總黃酮均明顯降低全血粘度，總生物堿、總黃酮和總環(huán)烯醚萜明顯降低壓積，且總生物堿和總黃酮還降低全血高切還原粘度，阿司匹林亦明顯降低全血粘度和壓積，均有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 黃連解毒湯各組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠血液流變性的影響（）

表2 黃連解毒湯各組分群對(duì)熱毒血瘀證大鼠血液流變性的影響（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 動(dòng)物 劑量 全血粘度 全血粘度 全血粘度 全血粘度 血漿粘度 壓積 全血高切 全血低切 紅細(xì)胞聚 全血低切 全血高切 紅細(xì)胞 紅細(xì)胞 纖維蛋切變率1 切變率 切變率 切變率 還原粘度 還原粘度 剛性指數(shù) 變形指數(shù) 白原(只) (g．kg-1) (1 mPa.S) (5 mPa.S) (30 mPa.S) (200mPa.S) (mPa.S) 相對(duì)指數(shù) 相對(duì)指數(shù) 集指數(shù) (mPa.S) (mPa.S) TK (g．L-1)正常對(duì)照 8 — 25.44±2.52 11.17±1.26 6.40±0.84 4.78±0.70 1.63±0.27 0.34±0.024 2.94±0.29 15.81±1.40 5.39±0.38 70.93±7.92 9.31±1.50 5.73±0.67 1.03±0.07 3.24±0.77模型對(duì)照 8 — 27.27±1.01* 12.54±0.96* 7.53±1.30* 5.80±1.37* 1.54±0.15* 0.38±0.03** 3.76±0.78 17.88±2.53* 4.92±1.07 68.17±7.20 11.05±2.53 7.17±1.46 1.07±0.04 3.34±0.36阿司匹林 8 0.200 22.90±2.72##9.66±0.97##5.32±0.45##3.87±0.30##1.38±0.96 0.35±0.01#2.80±0.11 16.52±1.07 5.91±0.43 61.91±8.97 7.14±0.76##5.16±0.34 0.97±0.04 3.99±1.06總黃酮 8 0.069 24.61±3.99#10.50±1.56##5.85±0.91##4.29±0.74##1.50±0.06 0.34±0.03##2.92±0.46 16.72±2.52 5.77±0.78 69.83±14.54 8.54±2.47#5.79±1.55 1.04±0.16 4.18±1.52總生物堿 8 0.061 23.41±2.43##10.16±1.19##5.76±0.88##4.27±0.77##1.23±0.37##0.35±0.01#4.29±3.10 17.44±1.41 5.55±0.65 63.12±6.24 8.770±2.32#9.36±8.89 1.14±0.29 4.11±0.98總環(huán)烯醚萜 8 0.110 24.87±1.93 11.47±0.94 6.88±0.85 5.30±0.83 1.44±0.12 0.35±0.03#3.69±0.58 17.35±2.26 4.79±0.83 66.75±6.39 10.87±1.61 7.57±1.27 1.14±0.08 2.33±1.06水提物 8 1.100 23.77±1.66##10.87±1.42##6.47±1.29#4.96±1.22 1.47±0.12 0.36±0.01 3.37±0.72 16.22±1.32 4.98±0.89 61．50±3．94 9．63±3．32 6．53±2．03 1．04±0．15 2．73±0．72

4 討論

本課題所選用的角叉菜膠聯(lián)合LPS引起的熱毒血瘀模型由梁愛華等[6]創(chuàng)建，以尾部血栓出現(xiàn)為模型表征，并在急性期（2-8 h）TNF-α、IL-6的表達(dá)明顯升高和凝血酶原時(shí)間、白細(xì)胞、全血粘度、白細(xì)胞粘附分子CD11b、CD18、TXB2等指標(biāo)的明顯改變，類似于中醫(yī)熱毒瘀證[7～8]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠尾部均出現(xiàn)顯著的血栓，結(jié)合實(shí)驗(yàn)中所測(cè)的指標(biāo)表明模型建立成功。現(xiàn)代藥理研究表明，黃連解毒湯對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的大腸桿菌和埃希菌均有一定程度的逆轉(zhuǎn)作用[9]，并對(duì)LPS引起的發(fā)熱有一定的解熱作用[10～12]。而對(duì)于LPS等外源性致熱源引起的發(fā)熱中，TNF和IL家族的細(xì)胞因子起著重要作用[13～14]。可直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞或影響內(nèi)皮素等釋放而引起血液流變性異常。本研究結(jié)果顯示，黃連解毒湯不同組分群預(yù)防給藥，可減輕LPS所致大鼠熱毒癥狀，并能改善其血液流變性，表明各提取物均有清熱活血作用，機(jī)制有待進(jìn)一步研究。總體來(lái)看，總生物堿和總黃酮均為有效組分群，又以總生物堿為主。

[1] 王利津,徐強(qiáng). 黃連解毒湯的抗炎作用機(jī)理研究[J]. 中國(guó)中藥雜志,2000, 25(8):493.

[2] 汪長(zhǎng)中,程惠娟,徐穎,等. 黃連解毒湯及其單味藥對(duì)體外白念珠菌生物膜影響的比較[J].上海中醫(yī)藥雜志,2008,42(2):63.

[3] 孫冬梅,鄺棗園,李巖,等.黃芩苷對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2011,32(13):2587.

[4] 宋玨,路通,謝林,等.以血清藥理學(xué)方法研究黃連解毒湯對(duì)小鼠的藥效動(dòng)力學(xué)[J].中草藥,2005,36(5):709.

[5] 趙保勝,劉永剛,王秀麗.黃連解毒湯解熱、抗炎作用研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009,15(11):55.

[6] 梁愛華,劉婷,李春英,等. 一種熱毒誘導(dǎo)的血栓形成動(dòng)物模型的建立[J].中國(guó)中藥雜志,2008,33(18):2124.

[7] 梁愛華,于長(zhǎng)安,李春英,等.內(nèi)毒素與角叉菜膠聯(lián)合誘導(dǎo)的血栓形成模型的動(dòng)物差異性比較[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(1):57.

[8] 梁愛華,丁曉霜,李文,等.血瘀證與血栓形成病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2005,30(20):1613.

[9] 蘆亞君,程寧.3種中藥方劑逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)觀察[J].西北藥學(xué)雜志,2007, 22(6):309.

[10] 朱兆榮,劉娟,楊敏,等.黃連解毒湯對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素致仔鴨發(fā)熱的影響[A].中國(guó)《活獸慈舟》學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C],2013.

[11] 郭月,于慶海,張毅.黃連解毒湯實(shí)驗(yàn)藥理研究[J].中成藥, 1993,15(8):29.

[12] 曹于平,皋聰,孫繼紅.黃連解毒湯提取物的藥理作用研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,27(10):605.

[13] Conti B, Tabarean I, Andrei C, Bartfai T. Cytokines and fever[J]. Front Biosci, 2004,1(9): 1433.

[14] 韓旭華,牛欣,閻妍,等.龍答草噴霧劑的解熱作用及對(duì)腫瘤壞死因子的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2005,20(8):469.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

Study of the infuence of active components groups extracted from Huanglian Jiedu decoction on rats with pattern of toxic heat-induced blood stasis

DU Qiao-hui1,2, XIE Xiao-fang1,2, PENG Cheng1,2, CAO Xiao-yu2, GONG Xiao-hong1,2, He-
Shu1,2, ZHOU Yan-xi1,2//(1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China; 2. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075)

Objective:To investigate the effects of constituents groups extracted from Huanglian Jiedu decoction (HLJDD) on rats of toxic heat-induced blood stasis pattern.Method:Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group, aspirin group and HLJDD constituents groups. The rats model were established after the drugs were administered orally for 5 days. Except the control group, the model rats of toxic heat-induced blood stasis pattern were established with carragheen and LPS. The general conditions, blood routine examination, marks of blood stream change were observed to evaluate the antipyretic and blood activating activity.Result:The levels of WBC, whole blood viscosity, hematocrit and whole blood low shear rate were all improved while the general conditions were worse in model rats. HLJDD components groups had a therapeutic effect on heat and blood stasis model to improve the general conditions and remarkably decrease the whole blood viscosity and hematocrit. The total alkaloids can even decrease whole blood high shear reductive viscosity (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion:The investigation reveals that HLJDD water extract, total alkaloids, total favonoids and iridoid has therapeutic effect on the model rat to amend the heat-toxic syndrome, increase the hemorrheology characteristic. And the total alkaloids may be the possible material basis of this effect.

Huanglian Jiedu decoction； toxic heat-induced blood stasis；active components group

R 285.5

A

1674-926X(2014)04-004-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（中藥有效成分群功效關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià)技術(shù)研究，2008BAI51B02）

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075

杜巧輝，碩士研究生，主要從事中藥有效性研究 Email:elvis_do@126.com

謝曉芳，博士，助理研究員，主要從事中藥復(fù)方藥理與毒理研究 Email:xxf14544@163.com；曹小玉，教授，主要從事中藥研究信息管理工作Email:cdzycxy@126.com

2013-11-11