高速逆流色譜分離青海鉤腺大戟化學(xué)成分

尚軍，張國燕，杜曉，陳志

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高速逆流色譜分離青海鉤腺大戟化學(xué)成分

尚軍，張國燕，杜曉，陳志

目的：研究青海鉤腺大戟根部的化學(xué)成分。方法：采用傳統(tǒng)提取分離方法與現(xiàn)代高速逆流色譜（HSCCC）法相結(jié)合的方式，對其甲醇提取物的石油醚萃取部位和二氯甲烷萃取部位所含化合物進行分離純化，確定適合的HSCCC溶劑體系。結(jié)果：分離得到化合物8個，經(jīng)鑒定為正二十八烷醇（I）、β-谷甾醇（II）、巨大戟醇（III）、巖大戟內(nèi)酯B（IV）、對映-阿替斯烷-16-烯-13(s)-羥基-3,14-二酮（V）、胡椒腦（VI）、β-香樹脂醇乙酸酯（VII）、槲皮素（VIII）。結(jié)論：化合物IV、VI、VIII為首次從該種植物中分離。

鉤腺大戟；高速逆流色譜；化學(xué)成分

鉤腺大戟(Euphorbia sieboldiana Morr. et Decne.)為大戟科多年生草本植物，別稱川布（藏名）、燈籠兒草，生于海拔3000米以下的河谷低階地、山坡和林下，全國大多數(shù)省區(qū)均有分布，是國產(chǎn)大戟屬中變異幅度較大的種之一。根狀莖為藥用部位，具瀉下和利尿的功效；水煎液外用治疔疥瘡類皮膚病；有毒，宜慎用[1]。鉤腺大戟根中含有多種具有抗腫瘤、抗病毒和抗菌等活性的二萜、三萜類化合物以及具有其他活性的鞣質(zhì)、甾醇、黃酮等化合物。本文以青海鉤腺大戟為研究對象，采用HSCCC對其活性成分進行系統(tǒng)分離、純化以及結(jié)構(gòu)鑒定，得到8個化合物，分別為：正二十八烷醇（I）、β-谷甾醇（II）、巨大戟醇（III）、巖大戟內(nèi)酯B（IV）、對映-阿替斯烷-16-烯-13(s)-羥基-3,14-二酮（V）、胡椒腦（VI）、β-香樹脂醇乙酸酯（VII）、槲皮素（VIII）。其中有IV、VI、VIII三個化合物為首次從該種植物中分離。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

TBE-300B高速逆流色譜儀（上海同田生化技術(shù)有限公司）；X-4精密顯微熔點測定儀（北京福凱儀器有限公司）；INOVA-400M超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士BRUKER公司，中科院蘭州化學(xué)物理所）；Mercury Plus 400質(zhì)譜儀（Varian，蘭州大學(xué)功能有機重點實驗室）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）；DZF-6050型真空恒溫干燥箱（上海迅博實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；AR2140型電子天平（Ohaus Corp. Pine Brook, NJ, USA）；ACD2-1005-U實驗室超純水系統(tǒng)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑與藥材

實驗所用的供試樣品為植物鉤腺大戟的根，于2011年10月采自青海省海南藏族自治州興海縣，該植物樣品由青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院陳志教授鑒定為植物鉤腺大戟的根。

其他所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 提取與萃取

將新鮮的鉤腺大戟根放置于通風(fēng)干燥處陰干，所得干燥根（約7.25 kg）經(jīng)小型粉碎機粉碎至100目以下，甲醇冷浸提取5次，料液比為1:10，每次7天，提取液減壓濃縮后，在55℃水浴鍋上繼續(xù)蒸干，直至表面變硬，放入真空干燥箱中真空干燥，去除剩余溶劑和水分，得總浸膏（約1.1 kg），得率為15.17%。

將浸膏分次用研缽研細(xì)，加適量蒸餾水使其混懸，依次用石油醚、二氯甲烷和正丁醇分段萃取。萃取液減壓濃縮，真空干燥后，得石油醚部分浸膏（約237 g），二氯甲烷部分浸膏（約74 g），正丁醇部分浸膏（約188 g）、水層部分（約342 g）和不溶物（約250 g）。

2.2 HSCCC分離純化

2.2.1 兩相溶劑系統(tǒng)的選擇 實驗采用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水混合溶劑體系不同比例作為HSCCC兩相溶劑系統(tǒng)（見表1），運用系統(tǒng)分離法對石油醚萃取物和二氯甲烷萃取物進行分離精制。

表1 兩相溶劑體系編號及對應(yīng)溶劑配比Table 1 The number of two-phase solvent systems and their solvent match

2.2.2 HSCCC工作條件 紫外檢測器檢測波長365 nm或254 nm，流動相流速2 mL/min，螺旋柱：正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速800～850 rpm/min。

3 結(jié)果

3.1 鉤腺大戟根化學(xué)成分的HSCCC分離和鑒定

稱取石油醚萃取物3.7 g，經(jīng)HSCCC SS1溶劑體系初步粗分離得到的6個混合組分峰（Fr 1-6），其中Fr2組分經(jīng)SS2溶劑體系HSCCC二次分離得1個單峰，濃縮，得單體化合物I（8.1 mg）；Fr3組分經(jīng)SS3溶劑體系HSCCC二次分離得1個單峰，濃縮，得單體化合物II（8.9 mg）；Fr4組分經(jīng)SS4溶劑體系HSCCC二次分離得2個單峰，濃縮，分別得淡黃色膠體單體化合物III（8.8 mg）和單體化合物IV（3.3 mg）；Fr5組分經(jīng)SS5溶劑體系HSCCC二次分離得2個單峰，濃縮，分別得到化合物V（6.7 mg）和VI（1.6 mg）；Fr6組分經(jīng)SS6溶劑體系HSCCC二次分離得1個單峰，濃縮，得化合物VII（3.6 mg）。

稱取二氯甲烷萃取物1.5 g，采用SS6溶劑系統(tǒng)進行分離，將多次進樣所得流份分段合并，其中主峰下降段濃縮后，加入氯仿有短針狀結(jié)晶析出，離心并洗滌后得到淡黃色針狀結(jié)晶粉末，即化合物VIII（3.6 mg）。

所得化合物通過UV、IR、1H NMR、13C NMR和MS 等方法確定其結(jié)構(gòu)。

3.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物I 白色無定形粉末（甲醇），m.p.77～78℃，MS m/z：410 [M-H]+，分子量為410.8，分子式為C28H58O；10%硫酸乙醇呈色顯紫紅色；1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ：3.62（2H, m, H-1），1.45（2H, m, H-2），0.88（3H, t, H-28）。與文獻(xiàn)[2]數(shù)據(jù)一致，由此推斷該化合物為：正二十八烷醇（1-octacosanol）。

化合物II 白色針狀晶體（丙酮），m.p.138.1～140.1℃，MS m/z：414 [M-H]+，分子量為414.7；香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯紫色；1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ：5.33（1H, s），3.51（1H, m），在2.30～1.00有1個由甾體骨架上大量-CH和-CH2的信號重疊導(dǎo)致的包峰，0.93～0.68之間（3H×6）為6個-CH3的系列峰。結(jié)合以上數(shù)據(jù)推測其分子式為C29H50O。經(jīng)驗證其與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品在TLC上經(jīng)多種展開劑展開，其Rf值一致，與參考文獻(xiàn)[3]對比鑒定為β-谷甾醇（β-sitosterol）。

化合物III 淡黃色膠體，MS m/z：371 [M+Na]+，分子量：348.4，分子式：C20H28O5；1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ：5.88（1H, d, J=1 Hz, H-1），4.37（1H, s, H-3），3.80（1H, br s, H-5），6.04（1H, d, J=5 Hz, H-7），4.12（1H, m, H-8），2.34（1H, m, H-11），2.26（1H, ddd, J=15, 8, 3Hz, H-12），1.76（1H, m, H-12′），0.70（1H, dd, J=15, 8Hz, H-13），0.93（1H, m, H-14），1.06（3H, s, H-16），1.12（3H, s, H-17），0.95（3H, d, J=7 Hz, H-18），1.84（3H, s, H-19），4.18（1H, m, H-20），4.08（1H, m, H-20′）。與文獻(xiàn)[4]一致，由此推斷該化合物為：巨大戟醇（ingenol）。

化合物IV 白色針狀晶體（石油醚-丙酮），m.p.217.5～218.2℃，MS m/z：331.2 [M+H]+，分子量為330，分子式為C20H36O4；1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）高場區(qū)δ：4個甲基單峰分別位于2.08（3H, s），0.94（3H, s），0.85（3H, s），0.82（3H, s）；低場區(qū)兩個具含氧取代的次甲基的δ：4.04（1H, s）和3.69（1H, s）。與文獻(xiàn)[3]一致，據(jù)此推斷該化合物為巖大戟內(nèi)酯B（Jolkinolide B）。

化合物V 無色片狀晶體（石油醚-乙酸乙酯），m.p. 162～163℃，MS m/z：316 [M]+，分子量為316，分子式為C20H28O3。1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）高場區(qū)δ：3個甲基單峰分別在1.09（3H, s），1.01（3H, s）和0.85（3H, s）；低場區(qū)δ：5.63（1H, s, H-17′）和4.86（1H, s, H-17）的兩個單氫信號峰為環(huán)外雙鍵上的亞甲基信號，且亞甲基周圍沒有氫原子對其產(chǎn)生偶合；3.89（1H, s）為含氧取代的次甲基中的質(zhì)子。與文獻(xiàn)[5]一致，由此推斷該化合物為：對映-阿替斯烷-16-烯-13(s)-羥基-3,14-二酮（atis-16-en-13(s)-hydroxy-3,14-dione）。

化合物VI 白色針狀結(jié)晶（石油醚-乙酸乙酯），MS m/z：357 [M+H]+，735 [2M+Na]+，分子式C20H20O6；1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ：6.77～6.89（6H, m, aorm. H），5.95（2H, s, OCH2O），5.60（1H, s, C-4″-OH），4.72（2H, d, J=4.2Hz, H-2和H-6），4.24（2H, m, He-4和He-8），3.88（2H, m, Ha-4和Ha-8），3.91（3H, s, C-3″-OCH3），3.06（2H, m, H-1和H-5）。與文獻(xiàn)[6]一致，據(jù)此推斷該化合物為胡椒腦（piperitol）。

化合物VII 不規(guī)則無色片狀晶體（石油醚），m.p. 243.2～244.2℃，TLC展開后噴濃硫酸-香草醛試劑顯藍(lán)紫色，表明為三萜類化合物；MS m/z：468 [M-H]+，分子量為468.8，分子式為C32H52O2；1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ: 0.82 （3H, s, 28-CH3），0.86（6H, s, 23和24-CH3），0.87（6H, s, 29和30-CH3），0.96（6H, s, 25和26-CH3），1.13（3H, s, 27-CH3），2.04 （3H, s, CH3CO），4.48～4.52（1H, t, J=8.02, J=8.06 H-12），5.16～5.19（1H, t, J=3.58, H-11）。與文獻(xiàn)[2]一致，由此推斷該化合物為：β-香樹脂醇乙酸酯（β-amyrin acetate）。

化合物VIII 黃色針晶粉末（甲醇），m.p. 310～312℃；MS m/z（%）：302 [M]+（100），274（10），分子量：302.23，分子式：C15H10O7；1H-NMR（DMSO-d6, 400 MHz）δ：12.48（1H, s, 5-OH），10.75（1H, s, 7-OH），6.17（1H, d, J=2.1Hz, 6-H），6.38（1H, d, J=2.1 Hz, 8-H），7.72（1H, d, J=21 Hz, 2’-H），6.87（1H, d, J=8.5 Hz, 5’-H），7.62（1H, dd, J=2.1, 8.5 Hz, 6-H）。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道一致，故鑒定化合物11為槲皮素（quercetin）。

4 結(jié)論

HSCCC是近年來新型發(fā)展的一種天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離制備的新技術(shù)，在天熱化學(xué)成分分離制備方面具有獨特的優(yōu)勢，上樣量范圍寬，樣品損失少或不損失，對于微量生物活性成分的制備具有非常大的優(yōu)勢。本實驗HSCCC采用紫外檢測器在365 nm或254 nm檢測波長，控制流動相流速2 mL/min，螺旋柱800～850 rpm/min正轉(zhuǎn)條件下，采用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水混合溶劑體系不同比例作為HSCCC兩相溶劑系統(tǒng)，經(jīng)多次分離得8個化合物。分離方法簡單可行，耗時少，效率高。

[1] 中國植物志編委會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1997, 44(3): 122.

[2] 郭生虎,朱金霞.鉤腺大戟根的化學(xué)成分研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(15): 6992.

[3] 丁利慶.紫薯中化學(xué)成分及其抗氧化活性的研究[D].浙江工商大學(xué),2011.

[4] 焦威,魯璐,鄧美彩,等.千金子化學(xué)成分的研究[J].中草藥, 2010, 41(2): 181.

[5] 丁毅力,劉育亭.阿替烷類型二萜衍生物的NMR研究[J].波譜學(xué)雜志,1992,9(3):276.

[6] 潘莉.唐古特瑞香和大果大戟的化學(xué)成分研究[D].中國科學(xué)院研究生院(成都生物研究所), 2006.

[7] 鄒忠杰.九節(jié)曹蒲、泥胡菜及寬葉大戟化學(xué)成分研究[D].中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué), 2006.

（責(zé)任編輯： 胡慧玲）

Separation of chemical compounds of Gouxiandaji roots in Qinghai by HSCCC

SHANG Jun, ZHANG Guo-Yan , DU Xiao, CHEN Zhi // (Qinghai Normal University, The Key Laboratory of Education Ministry on Environments and Resources in Qinghai-Tibet Plateau, Xining Qinghai 810008,China)

Objective:To investigate the chemical compounds of Gouxiandaji roots in Qinghai.Method:Traditional extraction method and high speed counter current chromatography（HSCCC）were used to separate and purify the petroleum ether fraction and dichloromethane fraction of the methanol extract of the roots of Gouxiandaji.Result:8 compounds were separated. On the basis of their physical constants and spectroscopic data, the compounds were identifed as:1-octacosanol (I), β-sitosterol (II), ingenol (III), Jolkinolide B (IV), atis-16-en-13(s)-hydroxy-3,14-dione (V), piperitol (VI), β-amyrin acetate (VII) and quercetin (VIII). Conclusion:Among them, three compounds IV、VI、VIII are isolated from this plant for the first time.

Gouxiandaji; HSCCC; chemical constituents

R 283

A

1674-926X(2014)03-001-03

科技部國家科技支撐項目（2012BAC08B04）

青海師范大學(xué)青藏高原環(huán)境與資源教育部重點實驗室，青海 西寧 810008

尚軍（1975年-），男，碩士研究生，講師，從事天然產(chǎn)物研究 Email:shjun2004@126.com

2014-01-07