兩種方法測定比沙可啶純度及不確定度評定

郭永輝，姜建國，閆 凱，韓學靜（河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050011）

比沙可啶為2010年版《中國藥典》收載的品種，是目前臨床上廣泛使用的通便劑。本文參考2010年版《中國藥典》及有關文獻[1-7]，采用高效液相色譜（HPLC）法與非水溶液電位滴定法對比沙可啶的純度進行了測定。依據標準物質技術規范及相關計量技術規范要求，分別對HPLC法與非水溶液電位滴定法測定比沙可啶純度的過程進行不確定度評定，并將兩種不同原理方法的測定結果進行聯合定值及不確定度評定。最終確定的比沙可啶純度值及其不確定度值準確可靠，更加準確地反映了比沙可啶的真實純度，有利于提高藥品的質控水平，同時對比沙可啶純度標準物質的研制與標定賦值提供了科學依據。

1 材料

1.1 儀器

e2695 HPLC儀（美國Waters公司）；DL-50自動電位滴定儀、XS105電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

比沙可啶原料藥樣品（河北康泰藥業有限公司，批號：130501，規格：每瓶10 g，HPLC純度：99.9%）；鄰苯二甲酸氫鉀基準試劑（KHP）為優級純，高氯酸、無水冰醋酸、醋酸酐均為分析純，結晶紫為試劑純，乙腈為色譜純，水為自制超純水。

2 HPLC法測定

2.1 色譜條件

根據文獻報道的HPLC條件[8]，采用與文獻不同的色譜柱，優化了流動相比例，對比沙可啶純度進行測定。色譜柱為Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈-水（60 ∶40，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為265 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10μl，進樣質量濃度為1 000μg/ml。記錄色譜圖及峰面積，利用面積歸一化法進行純度測定。比沙可啶的HPLC圖譜見圖1。

圖1 比沙可啶的HPLC圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of bisacodyl

2.2 方法學研究

2.2.1 供試品溶液的制備。精密稱取樣品25 mg，置于25 ml量瓶中，加流動相溶解并定容，配制成質量濃度為1 000.0μg/ml的溶液，即得。

2.2.2 線性關系考察。精密稱取樣品50.0 mg置于25 ml量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，配制成質量濃度為2 000.0μg/ml的貯備液；分別精密移取0.05、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0 ml至10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，獲得7種質量濃度樣品溶液（10.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μg/ml）。進樣測定，記錄色譜峰面積。以樣品質量濃度（x）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y＝7 743.2x+62 935（r＝1.000 0，n＝7）。結果表明，比沙可啶檢測質量濃度線性范圍為10.0～2 000.0μg/ml。

2.2.3 儀器精密度試驗。取供試品溶液連續重復進樣6次，記錄主峰面積，計算其RSD為0.19%（n＝6），結果表明儀器精密度良好。

2.2.4 方法重復性試驗。平行配制6份供試品溶液，每份重復進樣3次，結果6份樣品的峰面積平均值的RSD＝0.44%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.5 峰純度考察。根據比沙可啶二極管陣列檢測器（DAD）光譜圖，其最大吸收波長為220、265 nm。2個波長下檢出的色譜圖純度值均為99.88%，但在265 nm波長下比沙可啶主峰響應值高，基線平穩，無溶劑影響，且主成分色譜峰與雜質峰可達基線分離。故選取265 nm波長作為HPLC法的檢測波長。比沙可啶的DAD光譜圖見圖2。

圖2 比沙可啶的DAD光譜圖Fig 2 DAD chromatogram of bisacodyl

2.3 純度標準值的確定

2.3.1 數學模型。應用HPLC面積歸一化法進行標準物質候選物的純度測定，根據面積歸一化法計算公式，確定比沙可啶純度計算數學模型：WHPLC＝A化合物色譜峰面積/A總色譜峰面積×100%。式中：WHPLC表示化合物的相對純度，A化合物色譜峰面積表示被測化合物色譜峰面積值，A總色譜峰面積表示被測化合物加各雜質成分的色譜峰面積之和。

2.3.2 純度測定。①測定方法。按“2.2.1”項下方法平行配制10份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，每份重復進樣3次。比沙可啶色譜峰面積平均值為7 949 449，相對純度平均值為99.88%，總色譜峰面積平均值為7 959 193（詳細數據略）。②格拉布斯檢驗。將10組檢測數據進行格拉布斯檢驗，進行可疑值的剔除。將10組測量純度數據按從小到大的順序排列，可疑值不是最小值就是最大值。計算平均值（）和標準偏差（s）。計算偏離值：平均值與最小值之差為a1；最大值與平均值之差為a2。確定可疑值，即比較a1和a2，其中最大值確定為可疑值。純度平均值為99.88%，s＝5.683 3×10－5。經計算，格拉布斯G值為1.760。查格拉布斯臨界值表[5]知：G0.95（10）＝2.176。G＜G0.95（10），故在兩組數據中無可疑值存在。③標準值。由比沙可啶的純度測量數據確定比沙可啶HPLC面積歸一化純度值為99.88%，10組測量數據標準偏差為：s＝5.683×10－5。

2.4 其他雜質測定

由于HPLC面積歸一化法測定純度值的局限性，樣品中的水分、無機雜質和溶劑殘留均無法檢測，因此參照2010年版《中國藥典》附錄，分別采用卡爾費休水分測定法[1]、熾灼殘渣檢查法[1]、氣相色譜法[1]進行相關物質的檢測。結果表明，樣品中水分含量為0.020%、熾灼殘渣為0.036%、溶劑殘留為0.015%，合計0.071%。最終可得比沙可啶HPLC法純度標準值x1為：99.88%×（100%－0.071%）＝99.81%。

2.5 HPLC法不確定度評估

HPLC法引入的不確定度由“2.3.1”項下的數學模型可知，主要是由色譜峰面積引入，其中包含了由天平、量瓶以及色譜儀等因素帶來的各種影響因素。峰面積的不確定度計算公式為，式中u（A色譜峰）表示色譜峰引入的不確定度，s色譜峰表示色譜峰標準偏差，10表示測定次數。

標準物質的HPLC法合成不確定度計算公式為：uc（x1）＝式中，uc（x1）表示合成不確定度，WHPLC表示化合物的相對純度，u（A主峰）表示色譜主峰面積引入的不確定度值，u（A總色譜峰）表示色譜總峰面積引入的不確定度值，A主峰表示10組主色譜峰面積均值，A總色譜峰表示10組總色譜峰面積均值。

根據“2.3.2①”項中的相關數據計算，可得到HPLC法合成不確定度值為：uc（x1）＝0.141%。

根據標準JJF 1059-1999[2]，當不確定度分布為均勻分布且置信概率P為0.95時，擴展不確定度的包含因子k＝2，其擴展不確定度為：U（x1）＝k×uc（x1）＝2×0.141%＝0.282。

綜上，比沙可啶HPLC法純度標準值及不確定度分別為99.81%、（±）0.29%（k＝2，P＝0.95）。

3 非水溶液電位滴定法測定

3.1 測定方法

取樣品約0.30 g，精密稱定，加無水冰醋酸25 ml溶解，加萘酚苯甲醇指示液2滴，照2010年版《中國藥典》附錄ⅦB非水溶液滴定法[1]，在磁力攪拌下用0.1 mol/L高氯酸滴定液滴定，記錄消耗滴定液的體積，并將滴定結果用空白試驗校正，計算結果。本研究選擇電位法指示終點，并采用萘酚苯甲醇為指示劑進行滴定終點的輔助判斷，溶液顯黃綠色即為滴定終點。此方法不確定度具體評定過程將另文報道。

3.2 數學模型

以比沙可啶含量計算公式作為不確定度評定的數學模型。比沙可啶含量計算公式：A＝c×（V－V0）×M/m×100%。式中：A為以無水物計算所得比沙可啶的質量分數（%）；c為高氯酸滴定液的濃度（mol/L）；V為供試品消耗滴定液的體積（ml）；V0為空白試驗消耗滴定液的體積（ml）；M為無水比沙可啶的摩爾質量（g/mol）；m為供試品稱樣量（g）。

3.3 純度標準值的確定

按照“3.1”項下測定方法，雙人（甲、乙）獨立操作，每人測定10組，共20組測定數據。20組檢測數據進行格拉布斯檢驗，無可疑值。由比沙可啶的純度測量數據，確定非水溶液電位滴定法純度值x2為99.82%，s＝5.016×10－4。

3.4 非水溶液電位滴定法不確定度評估

不確定度各合成分量貢獻分析結果見表1。

表1 比沙可啶含量測定的不確定度評定結果Tab 1 Uncertainty evaluation of content determination of bisacodyl

計算合成標準不確定度：uc（x2）＝0.254%。P為0.95時，k＝2，其擴展不確定度：U（x2）＝k×uc（x2）＝2×0.254%＝0.508%。

綜上，比沙可啶非水溶液電位滴定法純度標準值及不確定度分別為99.82%、（±）0.51%（k＝2，P＝0.95）。

4 兩種方法的純度標準值和不確定度

4.1 純度標準值

使用t檢驗方法對不同原理獲得的純度值進行比較，檢查結果的一致性。經計算t＝0.88，自由度n＝21。查t分布雙側分位數表知＝2.08，兩種方法間t檢驗計算結果，t值小于臨界值，表明兩種方法數據結果一致。故取兩種方法的平均值作為比沙可啶的純度標準值，即（99.82%+99.81%）/2＝99.82%。

4.2 兩種不同原理方法總不確定度

根據CNAS-GL06化學分析中不確定度的評估指南[3]與相關文獻[7]，兩種不同原理方法總合成不確定度計算公式為：

式中，u（cx）表示合成不確定度，表示純度標準值，uc（x1）表示HPLC法合成不確定度，x1表示HPLC法純度標準值，uc（x2）表示非水溶液電位滴定法合成不確定度，x2表示非水溶液電位滴定法純度標準值。計算結果為uc（x）＝0.291%。P為0.95時，k＝2，其擴展不確定度為：

U（x）＝k×uc（x）＝2×0.291%＝0.582%。

4.3 比沙可啶含量標準值及不確定度

比沙可啶含量標準值及不確定度分別為99.82%、（±）0.59%（k＝2，P＝0.95）。

5 討論

（1）在比沙可啶HPLC法不確定度評定過程中，水分、無機雜質和溶劑殘留的含量測定值均較小（小于0.1%），對純度標準值的定值結果幾乎無影響，所以由其引入的不確定度可以忽略不計。

（2）本文采用HPLC和非水溶液電位滴定法兩種不同原理的分析方法聯合測定比沙可啶純度值，有效地避免了采用一種技術帶來的分析方法缺陷，使定值結果更加準確可靠。

（3）非水溶液電位滴定法為2010年版《中國藥典》（二部）中測定比沙可啶純度的法定方法，HPLC面積歸一化法為測定比沙可啶純度的經典方法，建立其不確定度評定方法十分重要，同時也為比沙可啶純度標準物質的研制和標定賦值工作提供了科學依據。本文建立的不確定度評估數學模型和定值方法與國際標準物質研制水平接軌，同時也為其他藥物進行純度測量、不確定度模型建立及標準物質評定提供了一定的參考。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：55，附錄ⅤE、ⅦB、ⅧM、ⅧN.

[2]國家質量技術監督局.JJF1059-1999測量不確定度評定與表示[S].1999-01-11.

[3]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-GL06化學分析中不確定度的評估指南[S].2006-06-01.

[4]國家質量監督檢驗檢疫總局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規程[S].2006-12-08.

[5]倪育才.實用測量不確定度評定[M].2版.北京：中國計量出版社，2004：27-34.

[6]國家質量技術監督局.中華人民共和國國家計量檢定規程：標準玻璃量器[S].2001-11-30.

[7]周浩輝，周政政，郭永輝，等.巖白菜素化學純度標準物質的定值及不確定度評價研究[J].中國藥房，2012，23（11）：1 005.

[8]王卉，杜春波，沈立，等.RP-HPLC法測定比沙可啶片劑含量及有關物質[J].藥學進展，2005，29（12）：565.