替尼泊苷注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

李 潔，陳娟紅，邵麗曉（武警浙江省總隊(duì)醫(yī)院，浙江嘉興 314000）

替尼泊苷注射液為抗腫瘤藥物，為周期特異性細(xì)胞毒類(lèi)藥物，通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期[1]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替尼泊苷對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞具有良好的抑制生長(zhǎng)作用，主要用于惡性淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和膀胱癌的治療[2]。《中國(guó)藥典》對(duì)注射劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限值作了明確的規(guī)定，傳統(tǒng)的熱原檢查法成本高、操作復(fù)雜、影響因素多、重現(xiàn)性差，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法則操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、成本低，已被廣泛應(yīng)用，但目前未見(jiàn)替尼泊苷注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過(guò)試驗(yàn)探討，建立用細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢查法檢查替尼泊苷注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性。

1 材料

1.1 儀器

BET-32細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天大天發(fā)科技有限公司）；ZH-2自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠(chǎng)）；BS-1300U型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；SC-101型鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱（浙江嘉興新塍電器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

替尼泊苷注射液（百時(shí)美施貴寶公司，批號(hào)：1M00553、2B01212、3C01331，規(guī)格均為：1 ml ∶10 mg，pH 6.5）；鱟試劑[湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1108201，標(biāo)示靈敏度（λ）：0.25 EU/ml；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：1203071，λ：0.125 EU/ml；規(guī)格：每支均為0.1 ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，批號(hào)：1010150，規(guī)格：每支10 EU）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號(hào)：1008123，規(guī)格：每支5 ml）均為湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

根據(jù)2批鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，將CSE用BET水溶解，置于漩渦混合器混合15 min，然后制成濃度為2λ、1λ、0.5λ、0.125λ（0.50、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml或0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/ml）4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2010年版《中國(guó)藥典》附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法復(fù)核試驗(yàn)用鱟試劑的靈敏度[3]，計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。λc＝antilg（∑X/4），X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值，而反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中的最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。結(jié)果2批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，詳見(jiàn)表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab 1 Recheck results of TAL sensitivity test

2.2 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

按2010年版《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒索檢查法的規(guī)定：L＝K/M，L為供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的限值。K為按規(guī)定的給藥途徑給藥人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU/（kg·h）。M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，從替尼泊苷注射液的使用說(shuō)明書(shū)可知本品的最大日推薦劑量是130 mg/m2[4]，推薦劑量以上則可能導(dǎo)致不良反應(yīng)的增加，供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體質(zhì)量的劑量。每天1次，人均表面積按1.62 m2計(jì)算，靜注時(shí)間按1 h計(jì)算[3]，由于本品為皮下注射或靜脈內(nèi)給藥，則K＝5 EU/（kg·h），M＝1.62×130×0.027/60（kg·h）＝0.094 77 mg/（kg·h），L＝K/M＝5/0.094 77＝53 EU/mg。根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》附錄“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”的要求，限值可適當(dāng)嚴(yán)格，至計(jì)算值的1/3～1/2，以保證安全，本試驗(yàn)安全系數(shù)定為3[3]，故L＝53/3＝18 EU/mg。

2.3 供試品最小有效稀釋質(zhì)量濃度（c）的確定

按2010年版《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒索檢查法的規(guī)定，最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）＝cL/λ。目前市售鱟試劑靈敏度最高為λ＝0.03 EU/ml，替尼泊苷注射液的規(guī)格均為1 ml ∶10 mg，計(jì)算得MVD＝cL/λ＝10×18/0.03＝6 000，由此可知，供試品稀釋倍數(shù)應(yīng)不大于6 000倍，即最小有效稀釋質(zhì)量濃度c1≥0.001 7 mg/ml，由此進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以確定最大不干擾濃度。

2.4 預(yù)干擾試驗(yàn)[5]

取3批次替尼泊苷注射液各1瓶，用BET水稀釋至125倍，而后用BET水倍比稀釋至125、250、500、1 000、2 000、4 000倍，連同原液制成10、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5 mg/ml共7個(gè)濃度梯度溶液，將此系列濃度溶液標(biāo)記為供試品管（NPC系列，各2管）；用上述稀釋液作為溶劑，分別溶解并稀釋CSE，制得每個(gè)稀釋度中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均為2.0λ（0.5或0.25 EU/ml）的替尼泊苷液，標(biāo)記此系列溶液為陽(yáng)性對(duì)照管（PPC系列，各2管）。同時(shí)做細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照管（PC）及BET水陰性對(duì)照管（NC）各2管，然后按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作，進(jìn)行預(yù)干擾試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 樣品預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果（λ＝0.25 EU/ml）Tab 2 Results of preliminary interference test of sample（λ＝0.25 EU/ml）

表3 樣品預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果（λ＝0.125 EU/ml）Tab 3 Results of preliminary interference test of sample（λ＝0.125 EU/ml）

由表2結(jié)果可知，3批樣品稀釋至0.02 mg/ml或以下質(zhì)量濃度的溶液時(shí)，對(duì)λ為0.25 EU/ml的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾作用。

由表3結(jié)果可知，3批樣品稀釋至0.01 mg/ml或以下質(zhì)量濃度的溶液時(shí)，對(duì)λ為0.125 EU/ml的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾作用。

2.5 干擾試驗(yàn)[6]

根據(jù)預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，取3個(gè)批號(hào)的替尼泊苷注射液，對(duì)應(yīng)相應(yīng)的鱟試劑靈敏度，用BET水稀釋成0.02 mg/ml（500倍）、0.01 mg/ml（1 000倍）質(zhì)量濃度的樣品稀釋溶液，并用此樣品稀釋溶液將CSE分別稀釋成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ系列濃度，按2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行干擾試驗(yàn)。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算Es和Et，計(jì)算公式分別為Es＝antilg（∑Xs/4）和Et＝antilg（∑Xt/4）[Xs系用BET水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg），Xt系用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg），Es系用BET水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Et系用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值]，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of interference test of sample

由表4結(jié)果顯示，2種不同靈敏度的鱟試劑Es在2λ～0.5λ之間，且Et在2Es～0.5Es之間，表明替尼泊苷注射液稀釋液≤0.02 mg/ml對(duì)λ為0.25 EU/ml的鱟試劑試驗(yàn)無(wú)干擾，替尼泊苷注射液稀釋液≤0.01 mg/ml對(duì)λ為0.125 EU/ml的鱟試劑試驗(yàn)無(wú)干擾，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

試驗(yàn)中采用的2種不同靈敏度的鱟試劑（λ1＝0.25 EU/ml；λ2＝0.125 EU/ml），相對(duì)應(yīng)的MVD1＝cL/λ＝10×18/0.25＝720，MVD2＝cL/λ＝10×18/0.125＝1 440，而干擾試驗(yàn)的結(jié)果分別為500、1 000倍，小于對(duì)應(yīng)的MVD1、MVD2，符合《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查要求，因而可進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。取3個(gè)批號(hào)的供試品，對(duì)應(yīng)于λ＝0.25 EU/ml鱟試劑，用BET水500倍稀釋?zhuān)╟＝0.02 mg/ml）；對(duì)應(yīng)于λ＝0.125 EU/ml鱟試劑，用BET水1 000倍稀釋?zhuān)╟＝0.01 mg/ml）；按文獻(xiàn)[4]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并按要求對(duì)應(yīng)相應(yīng)的鱟試劑，平行做陽(yáng)性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 5 Results of bacterial endotoxin test of sample

由表5結(jié)果可知，NPC和NC陰性對(duì)照管均為陰性，表明樣品中未檢出細(xì)菌內(nèi)毒素；PPC和PC陽(yáng)性對(duì)照管均為陽(yáng)性，表明試驗(yàn)有效。試驗(yàn)表明，用2種靈敏度的鱟試劑，對(duì)3個(gè)批次替尼泊苷注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論

預(yù)干擾試驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)價(jià)樣品質(zhì)量濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度，初步篩出對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾的樣品濃度范圍。而干擾試驗(yàn)的目的則是對(duì)預(yù)干擾試驗(yàn)初步篩出無(wú)干擾的樣品質(zhì)量濃度的進(jìn)一步確認(rèn)。另外，不同廠(chǎng)家的鱟試劑由于生產(chǎn)工藝、質(zhì)量參數(shù)等方面有一定差異，其抗干擾能力存在差異[7-8]。由于替尼泊苷結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，較高質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)的凝集有一定的干擾，但通過(guò)BET水的稀釋則完全可以排除干擾。本試驗(yàn)采用2個(gè)不同廠(chǎng)家的鱟試劑（λ1＝0.25 EU/ml、λ2＝0.125 EU/ml）對(duì)3個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)應(yīng)將樣品稀釋至質(zhì)量濃度≤0.02 mg/ml、≤0.01 mg/ml時(shí)，不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。因此，替尼泊苷注射液用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的。

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