胃癌中p-Stat3活化和SOCS3表達的臨床病理意義及其對預后的影響＊

陳海云，張 楠，從 麗，陶 林，趙 瑾，李秀明，張 微，張文杰

（石河子大學醫學院病理學系／地方與民族高發病教育部重點實驗室，新疆石河子832002）

胃癌是全球范圍內威脅人類健康的最常見惡性腫瘤之一。受環境、遺傳、感染等多種因素影響，胃癌發病機制十分復雜。近年隨著分子生物學研究的不斷深入，發現乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞中，存在Jak-Stat3信號傳導通路的原發性異常活化，而這種異常活化可能在惡性腫瘤的增殖、浸潤和轉移中發揮重要作用。信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，Stat3）是一種重要的核轉錄因子，它的活化是Jak-Stat3信號傳導通路激活的“開關”[1]。細胞因子信號轉導抑制蛋白3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）是細胞因子信號傳導負調控蛋白家族的成員之一，是Jak-Stat3信號傳導通路的重要抑制因子。目前研究發現，SOCS3表達缺失或減少可能是導致惡性腫瘤發生的重要原因之一[2]。然而，Stat3和SOCS3在胃癌的發生、發展和預后中的作用尚不明確，迄今報道甚少。本研究通過檢測胃癌及癌旁組織中活化的Stat3（p-Stat3）及SOCS3的表達水平，結合患者的臨床病理及隨訪資料，探討Stat3信號通路及其調節因子SOCS3在胃癌的發生、發展中的作用以及對患者預后的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選自石河子大學附屬第一醫院2003年1月至2007年12月手術切除的標本胃癌組織53例（胃癌組），全部病例術前均未行放、化療，資料完整，胃癌組織分期參照AJCC（2010）的TNM分期標準[3]，其中男36例，女17例，年齡29～79歲，平均62歲；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移者22例，發生遠處轉移2例。根據WHO（2000年）病理組織學分類：高分化管狀腺癌5例，中分化管狀腺癌16例，低分化管狀腺癌24例，黏液腺癌4例，印戒細胞癌4例。選取其中27例胃癌患者的癌旁組織（切緣距離癌組織5cm以外的非癌組織）作為對照組。對所有資料進行隨訪，生存時間為自手術當日至患者死亡或截止到隨訪日期，隨訪日期截止到2012年12月31日。

表1 p-Stat3及SOCS3的表達水平（n）

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 所有組織標本均置于10%中性福爾馬林固定，然后石蠟包埋，以4μm厚度連續切片。免疫組織化學染色法采用Envision兩步法。特異性抗體：第一抗體分別為兔抗人p-Stat3（Tyr 705）單克隆抗體（美國 Abcam公司，ab76315，稀釋度1∶200）和兔抗人SOCS3單克隆抗體（美國Abcam公司，ab119313，稀釋度1∶150）。其余試劑均購自北京中杉金橋生物有限公司。分別用已知p-Stat3染色陽性的乳腺癌組織及已知SOCS3染色陽性的腎癌組織作為陽性對照；PBS液為陰性對照。

1.2.2 結果判定 由2名高年資病理醫師采用雙盲法，參照1996年全國免疫組織化學技術與診斷標準化專題研討會意見獨立閱片。定義p-Stat3為組織切片中的細胞核呈淺黃色至棕褐色顆粒為陽性觀察對象，SOCS3為組織切片中的細胞質呈淺黃色至棕褐色顆粒為陽性觀察對象。400倍光學顯微鏡下隨機選取10個不同視野，每個視野分別計數100個同類細胞。染色得分由陽性染色細胞占細胞總數的百分比與染色強度計分的乘積判斷。按陽性細胞數計分：＜5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。按染色強度計分：無著色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項結果相乘：0～1分為（-），2～4分為（＋），5～8分為（＋＋），9～12分為（＋＋＋）；（-）為陰性，（＋）為弱陽性，（＋＋～＋＋＋）為強陽性[4]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。兩個免疫組織化學指標在癌與非癌差異間的比較采用χ2檢驗；兩個免疫組織化學指標在臨床生物學行為差異之間的比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法；兩指標之間的相關性采用Spearman等級相關分析；采用Kaplan-Meier法對生存曲線和生存期進行描述，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 p-Stat3及SOCS3的表達水平 兩種免疫組織化學指標在細胞質、細胞核中均有陽性表達。正常胃組織中p-Stat3的陽性信號主要位于細胞質，胃癌中p-Stat3的陽性信號主要位于細胞核，腫瘤組織中p-Stat3的染色較深；SOCS3的陽性信號主要定位于上皮細胞的細胞質，胃癌中SOCS3的表達范圍較小，但染色較深（圖1、2）。胃癌組織的細胞核中p-Stat3的陽性率為60.4%，癌旁組織細胞核中p-Stat3的陽性率為14.8%，胃癌組織細胞核中p-Stat3水平明顯高于相應癌旁組織；胃癌組織細胞質中SOCS3的陽性率為41.5%，癌旁組織細胞質中SOCS3的陽性率為92.6%，胃癌組織細胞質中SOCS3的表達明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 胃癌及癌旁組織中p-Stat3的表達（Envision法，×400）

圖2 胃癌及癌旁組織中SOCS3的表達（Envision法，×400）

2.2 胃癌組織中p-Stat3及SOCS3的表達水平與臨床病理特征的關系 胃癌組織細胞核中p-Stat3呈強活化水平，強陽性率為60.4%。p-Stat3水平與患者年齡、性別中無明顯相關性，差異無統計學意義（P＞0.05）；浸潤深度T1＋T2（即腫瘤未侵達漿膜層）中p-Stat3的強陽性率低于浸潤深度T3（即腫瘤侵及漿膜層）中，二者差異有統計學意義（P＜0.05）；有淋巴結轉移組p-Stat3的強陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，差異無統計學意義（P＞0.05）；組織學分型中高分化組p-Stat3的強陽性率明顯低于中＋低分化組，差異有統計學意義（P＜0.05）。p-Stat3的活化水平與腫瘤的TNM分期呈正相關（P＜0.05）。SOCS3在胃癌組織表達水平較低，陽性率為41.5%。SOCS3的表達與腫瘤患者的年齡、性別無相關性（P＞0.05）；T1＋T2中SOCS3的陽性率明顯高于T3，二者差異有統計學意義（P＜0.05）；有淋巴結轉移組SOCS3陽性率低于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0.05）；臨床分期Ⅰ＋Ⅱ期SOCS3的陽性率高于Ⅲ＋Ⅳ期，差異有統計學意義（P＜0.05）；SOCS3的表達與遠處轉移及組織學分化差異無相關性（P＞0.05），見表2。

2.3 胃癌中p-Stat3活化與SOCS3表達的相關性 Spearman等級相關分析，結果顯示兩指標顯著負相關（r＝-0.492，P＜0.05）。

2.4 生存分析 53例胃癌患者中，34例存活，19例死亡，中位生存時間為80.00個月（約6.7年）；細胞核中p-Stat3（-～＋）的患者，中位生存時間為72.00個月，細胞核中p-Stat3（＋＋～＋＋＋）的患者，中位生存時間為33.04個月；細胞質中SOCS3（-）表達的患者中，中位生存時間只有28.38個月，細胞質中SOCS3（＋～＋＋＋）表達的患者中，中位生存時間為84.00個月；Kaplan-Meier生存分析結果顯示：細胞核中p-Stat3的活化水平與胃癌患者的生存時間呈顯著負相關（χ2＝-5.05，P＜0.05）；細胞質中SOCS3的表達與胃癌患者的生存時間呈顯著正相關（χ2＝10.852，P＜0.05），見圖3、4。

圖3 p-Stat3水平與生存時間呈負相關

圖4 SOCS3表達與生存時間呈正相關

表2 p-Stat3、SOCS3與胃癌患者臨床病理特征的關系[n（%）]

續表2 p-Stat3、SOCS3與胃癌患者臨床病理特征的關系[n（%）]

3 討 論

研究發現原發性異常活化的p-Stat3與多種惡性腫瘤密切相關。外界刺激因子如IL-6，作用于細胞膜上相應的細胞因子受體（gp130）后，激活細胞質內的Jak酪氨酸激酶，使Stat3蛋白活化為p-Stat3。p-Stat3有進入細胞核的能力，可以激活下游一系列的原癌基因，加重腫瘤的惡性行為[1]。SOCS3也是p-Stat3的下游分子，通過細胞核內的p-Stat3激活。正常情況下，存在于細胞核的SOCS3激活后轉移到細胞質，負反饋調節上游Jak-Stat3信號轉導通路，抑制Jak-Stat3的異常激活[2]。因此，細胞核中的p-Stat3有促進細胞惡化的潛能；細胞質中的SOCS3有抑制Stat3信號通路激活的能力。所以，本免疫組織化學定義：p-Stat3為組織切片中的細胞核呈淺黃色至棕褐色顆粒為陽性觀察對象，SOCS3為組織切片中的細胞質呈淺黃色至棕褐色顆粒為陽性觀察對象。

本研究結果發現，胃癌中p-Stat3的陽性信號主要位于細胞核，呈強活化狀態。癌旁組織細胞核中p-Stat3的活化水平明顯低于胃癌組織，可見Stat3過度活化可以增強胃癌細胞瘤性轉化的能力，對胃癌的啟動起到的明顯促進作用。這一點在Tye的裸鼠實驗中也得到證實[5]。活化的Stat3可以啟動下游基因的表達，包括Cyclin D1、BCL-XL、VEGF以及Pim3等，進一步影響腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移能力。本結果顯示，胃癌中p-Stat3的活化水平與腫瘤的浸潤深度、臨床分期顯著相關。胃癌發展的早期p-Stat3的活化水平明顯低于晚期胃癌。然而筆者發現，無淋巴結轉移組p-Stat3的強陽性率雖然高于無淋巴結轉移組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。Deng等[6]的研究發現，胃癌中Stat3的活化水平與淋巴結轉移有關，與本研究結果不一致。分析可能由于樣本量的差異，后期將擴大樣本量，進行相關探討。本研究結果顯示，SOCS3的陽性信號主要定位于上皮細胞的細胞質，與癌旁組織相比，胃癌組織細胞質中SOCS3表達水平較低。研究表明，SOCS3的DNA啟動子區甲基化是SOCS3表達缺失的重要原因[7]。賈芙蓉等[8]用RT-PCR檢測胃癌組織及胃癌細胞中SOCS3的mRNA表達情況，同樣顯示胃癌中SOCS3的表達顯著低于胃正常組織。所以，SOCS3表達的減少可能參與了胃癌的啟動。本研究結果顯示，SOCS3的表達缺失與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期呈負相關關系，隨著SOCS3表達的缺失，胃癌細胞的生物學行為也在逐漸惡化。推測可能由于SOCS3的表達減弱，影響了促癌基因的表達。有結果發現SOCS3表達缺失可以促進VEGF的表達[9]。關于SOCS3與胃癌的發展關系，目前研究較少，有必要進行更加深入地探討。

機制研究表明，SOCS3可以通過負反饋作用于Jak-Stat3信號轉導通路來抑制Stat3活化，體外實驗發現沉默SOCS3可以減弱這種負反饋作用，增強Stat3的活化能力。本研究探討了胃癌中p-Stat3活化和SOCS3表達的相關性，結果證實Stat3活化和SOCS3表達存在明顯的負相關關系，與目前的結論一致。也就是說，Stat3活化水平異常增高及SOCS3表達缺失可能協同參與了胃癌的發展。但由于免疫組織化學方法的限制，引起p-Stat3活化與SOCS3缺失的具體機制尚不明確，有待進一步研究。

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，細胞核中Stat3的活化水平越高的胃癌患者，其生存時間越短（χ2＝-5.05，P＜0.05）。Xiong等[10]的研究結果也表明Stat3的高活化狀態可能與胃癌患者的預后差相關。本研究首次提出胃癌患者的生存時間與細胞質中SOCS3的表達缺失有關（χ2＝10.852，P＜0.05），隨著SOCS3表達下降，胃癌患者的生存時間逐漸縮短。這些結果提示，SOCS3的表達，特別是高表達，可能是影響胃癌患者預后的保護性因素；而p-Stat3水平增高則是胃癌預后的不利因素，二者相互作用，影響胃癌的發生、發展[11]。

p-Stat3水平異常增高及SOCS3表達缺失可能協同參與胃癌的發展及轉移進程，提示p-Stat3和SOCS3信號傳導通路分子在癌變及癌進展中具有重要作用，為胃癌的靶向性治療提供新靶標。同時，他們對胃癌患者存活的影響表明，p-Stat3和SOCS3也可能作為胃癌患者預后的參考指標。

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