蓽茇明堿對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖及凋亡的影響＊

姚建新，姚志峰，李占峰，劉永彪

（1.江蘇聯合職業技術學院南京衛生分院醫學影像系，南京210038；2.南京醫科大學第二附屬醫院放射腫瘤科 210011；3.南京醫科大學第一附屬醫院腫瘤放射治療科 210029）

蓽茇明堿（piplartine，PL）是從胡椒科植物蓽茇根中分離得到的生物堿類化合物，具有諸如鎮痛、鎮靜、抗血小板凝集、抗真菌、抗血吸蟲、抗焦慮以及抗抑郁等多種生理及藥理活性[1-4]。近年來研究發現，PL對多種腫瘤細胞具有特異性的細胞毒作用，可顯著抑制多種人類腫瘤細胞的生長增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞沒有明顯毒性作用[5-8]。然而，目前有關PL抗乳腺癌的具體作用機制仍不太清楚。本研究旨在研究PL對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、凋亡的影響及可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中科院上海細胞庫。采用含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM完全培養液（內含青-鏈霉素100U／mL），置于含5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養，為單層貼壁生長。每2～3天傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 試劑與儀器 PL：分子式C17H19NO5，相對分子質量317.34，由華東師范大學化學化工學院合成（純度大于99%）。用二甲亞砜（DMSO）配成濃度為5mmol／L的儲備液，過濾除菌，置于-20℃冰箱保存。使用時用無血清培養基逐級稀釋至設定實驗濃度（DMSO濃度小于0.1%）。高糖DMEM培養基、0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青-鏈霉素溶液為GIBCO公司產品；FBS購于杭州四季青生物工程材料有限公司；活細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本株式會社同仁化學研究所；DMSO、Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒為南京凱基公司產品；乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物工程公司產品。Bcl-2／Bax鼠抗人單克隆抗體、β-actin羊抗鼠單克隆抗體、辣根過氧化酶（HRP）標記羊抗鼠單克隆抗體均購于Santa Cruz公司。其余為國產分析純試劑。主要儀器有酶標儀（Thermo公司），流式細胞儀（FACS Calibur，美國庫爾特公司）。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8法檢測PL對 MDA-MB-231細胞的增殖抑制率 將MDA-MB-231細胞用0.25%的胰酶消化，制備成單細胞懸液，以5×104個／mL的密度接種到96孔培養板，每孔100μL，培養24h后，更換培養液，加入1.0、2.5、5.0和10.0 μmol／L的PL細胞培養液250μL。每一濃度設5個復孔，加藥后的細胞繼續培養24、48或72h。于實驗終止前4h，每個孔內加入10μL的CCK8試劑，將96孔板置培養箱內培養4 h，在450nm波長處用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度（A）值。溶劑對照組：加入相同體積含終濃度為0.1%DMSO的完全培養基；空白對照組：不加細胞只加培養基。比色時以空白孔調零。各藥物濃度重復3次，細胞相對增殖抑制率＝[1-（PL組A值-空白對照組A值）]／（溶劑對照組A值-空白對照組A值）×100%。

表1 不同濃度的PL對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率（±s，n＝3）

表1 不同濃度的PL對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率（±s，n＝3）

-：表示此項無數據。

組別24h A值 增殖抑制率（%）48h A值 增殖抑制率（%）72h A值 增殖抑制率（%）- 0.063±0.010 - 0.076±0.015 - 0.092±0.021 -溶劑對照組 0.1%DMSO 1.365±0.442 - 1.605±0.023 - 1.932±0.013 -PL組 1.0μmol／L 1.254±0.017 8.52 1.366±0.094 15.62 1.425±0.037 27.56 2.5μmol／L 1.084±0.052 21.58 1.156±0.033 29.35 1.037±0.230 48.64 5.0μmol／L 0.920±0.023 34.18 0.992±0.056 40.12 0.803±0.091 61.34 10.0μmol／L 0.475±0.046 68.36 0.465±0.028 74.55 0.457±空白對照組0.036 80.16

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，用0.25%的胰酶消化細胞，調整細胞密度，約5×105個／mL，接種于6孔培養板中，貼壁培養24h后，每孔1mL，實驗分為3組：（1）對照組（僅含DMSO和細胞的培養液）；（2）PL組，藥物濃度為5μmol／L；（3）PL＋NAC組，用抗氧化劑NAC 3mmol／L預孵育1h后加入5μmol／L PL孵育細胞48h。每組設3個復孔。0.25%胰酶消化，離心，重懸，PBS液洗滌2遍，收集各組細胞，經AnnexinV-FITC和PI雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。以上實驗重復3次。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達 不同濃度PL分別作用細胞48h后，收集細胞，預冷的PBS洗2遍，離心。加適量預冷的細胞裂解液，置于冰上裂解30min，12 000r／min于4℃離心20min，取上清液備用。按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白，并調整各組蛋白質量濃度一致。蛋白提取物經定量后，各組取等量蛋白加入等量10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液，并置95～100℃沸水中變性5min，行SDS-PAGE垂直電泳。電轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，麗春紅染色觀察轉膜情況。加5%的脫脂奶粉于4℃冷庫封閉過夜，TBST緩沖液洗膜1.5h后加一抗Bcl-2，Bax鼠抗人單克隆抗體，內參照β-actin羊抗鼠單克隆抗體（均為1∶1 000稀釋），過夜孵育，TBST洗膜1.5h后加HRP標記羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h，TBST洗膜40min后ECL試劑顯色、曝光，并翻拍成照片。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PL對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響 不同濃度的PL處理MDA-MB-231細胞24、48、72h，各濃度組在不同時間點的增殖抑制率與溶劑對照組相比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

2.2 PL對MDA-MB-231細胞凋亡的影響 PL作用48h后可檢測到明顯的細胞凋亡，凋亡率（24.70±1.62）%，與對照組凋亡率（2.20±0.35）%相比較，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）；PL＋NAC組的凋亡率為（9.50±0.98）%，明顯低于PL組的凋亡率，兩者差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2、3。

圖1 增殖抑制率隨濃度和時間的變化

圖2 各組細胞凋亡情況 （±s，n＝3）

圖3 各組細胞凋亡情況

2.3 Western bolt檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達水平 隨著PL濃度的增加，Bcl-2蛋白表達減弱，Bax蛋白表達增強，各濃度組細胞的Bcl-2與Bax的灰度比值之間差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4、表2。

圖4 PL對Bax和Bcl-2蛋白表達情況的Western bolt檢測結果

表2 PL對Bcl-2、Bax蛋白表達的影響（±s，n＝3）

表2 PL對Bcl-2、Bax蛋白表達的影響（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與PL 0μmol／L組比較；b：P＜0.05，與PL 2.5μmol／L組比較；c：P＜0.05，與PL 5.0μmol／L組比較。

Bax PL 0μmol／L組組別Bcl-2 Bax Bcl-2／1.98±0.05 0.36±0.03 5.50±0.32 PL 2.5μmol／L組 1.22±0.02a 0.75±0.01a 1.63±0.05a PL 5.0μmol／L組 0.82±0.08ab 1.06±0.04ab 0.77±0.02ab PL 10.0μmol／L組 0.78±0.01abc 1.32±0.15abc 0.59±0.03abc

3 討 論

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，內分泌治療和分子靶向藥物注射用曲妥珠單抗均無效，而且TNBC更易局部復發和遠處轉移，是各種乳腺癌亞型中惡性程度最高、預后最差的一類[9]。相當一部分抗腫瘤藥物的開發基于天然化合物。PL作為一種從胡椒科植物蓽茇的根中分離得到的生物堿類化合物，對諸如白血病細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞以及結腸癌等多種人腫瘤細胞有增殖抑制作用，而不影響正常細胞的生長[6-7，10-13]。

本研究對PL對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡誘導作用及其潛在機制進行探討。首先使用CCK-8法觀察PL對腫瘤細胞增殖的抑制作用，結果顯示，1.0、2.5、5.0和10.0 μmol／L PL作用人乳腺癌 MDA-MB-231細胞24、48、72h，均能抑制細胞的增殖，且呈濃度、時間依賴關系，PL組與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。本結果與Bezerra等[14]的研究類似，他們發現PL能顯著抑制 HL-60、K562、Jukart、Molt-4等白血病細胞的增殖，并且認為兩個α、β不飽和羰基部分是其發揮細胞毒性的結構基礎[15-16]。本研究證實了PL對MDA-MB-231細胞同樣產生細胞毒作用，然而其抗腫瘤作用卻不十分清楚，為此筆者從誘導TNBC細胞凋亡的角度闡述其作用機制。本實驗使用Annexin-V／PI雙染法檢測了MDA-MB-231細胞的凋亡情況，結果發現5.0μmol／L的PL即引起了 MDA-MB-231細胞的明顯凋亡。Kong等[17]研究發現，用PL處理的前列腺癌PC-3細胞在光鏡和熒光顯微鏡下出現空泡化、染色體濃集現象以及凋亡細胞的增加等典型表現，從形態學方面證實了PL能促進前列腺癌細胞的凋亡。Raj等[6]研究發現，PL誘導腫瘤細胞凋亡的重要機制之一是通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）應激反應途徑靶向殺傷腫瘤細胞，他們發現PL能升高腫瘤細胞內ROS水平，對應的細胞凋亡率也會增加，而對正常細胞無明顯影響。有研究指出，與正常細胞相比，腫瘤細胞對ROS更敏感，提出可以通過PL介導腫瘤細胞ROS的動態平衡達到靶向殺傷腫瘤細胞，而不對正常組織細胞造成損傷的抗癌新策略[18]。NAC作為一種抗氧化劑，理論上可有效抑制腫瘤細胞內ROS水平升高，故本研究使用NAC的目的就在于觀察PL所誘導的ROS水平降低對腫瘤細胞凋亡有無影響。結果發現PL＋NAC組的細胞凋亡率明顯低于PL組，進一步證實了ROS在PL誘導細胞凋亡過程中所起的重要作用，為ROS應激反應途徑的凋亡機制提供了直接佐證。

在細胞凋亡的調控基因中，Bcl-2家族是目前發現的與凋亡關系密切的原癌基因之一[19]。Bcl-2與Bax作為Bcl-2家族中的代表，當細胞內Bcl-2較多時，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，凋亡趨勢減弱；當細胞內Bax較多時，則Bax本身形成的同源二聚體占主導，則易于發生凋亡。因此Bcl-2／Bax異源二聚體形成的調節是一個重要細胞凋亡調控方式，Bcl-2／Bax蛋白比例的變化作為細胞凋亡的最下游機制，對決定細胞是否進入凋亡狀態有重要意義。PL是否通過調節Bcl-2家族蛋白的表達誘導MDA-MB-231細胞的凋亡。因此，本研究觀察了PL對凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2相對表達的影響，結果表明，隨著PL濃度的增加，Bcl-2的表達逐漸減少。這與Kong等[17]的研究發現，PL對前列腺癌PC-3細胞作用的結果類似，所不同的是他們發現PL作用于PC-3細胞后，Bax蛋白的表達未見明顯改變。本研究則發現，Bax的表達隨PL濃度的增加而逐漸增加，而Bcl-2／Bax均降低。這可能由于所選用細胞株或者實驗方法的不同使得PL引起Bax表達出現不同情況。因此，筆者推測PL很可能通過改變Bcl-2／Bax異源二聚體的調控平衡來誘導MDA-MB-231細胞凋亡的。有研究指出，Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax表達上調以及凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調，從而使caspase-3的活化，并最終導致細胞凋亡很可能是通過ROS途徑介導的[20]。Bcl-2抗凋亡機制之一是其作為抗氧化劑，調節細胞氧化還原狀態，阻斷氧化作用對細胞組成成分的破壞，這與本研究中的NAC抑制腫瘤細胞凋亡似乎有某種相似之處。

綜上所述，本研究認為PL對乳腺癌MDA-MB-231細胞具有增殖抑制、誘導凋亡的作用，并且認為凋亡誘導效應可能與Bcl-2蛋白表達的減少和Bax蛋白表達增加有關。PL在微摩爾濃度即表現出對腫瘤細胞明顯的促進凋亡和增殖抑制作用，對于PL的其他可能抗腫瘤機制仍待深入研究，故開展PL動物模型的研究將有助于進一步明確其抗腫瘤的作用機制。

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