兩種自體靜脈移植再狹窄大鼠模型的對比研究＊

劉盛華，王武軍

（南方醫科大學附屬南方醫院胸心血管外科，廣州510405）

自體靜脈移植動物模型是研究冠狀動脈旁路移植（coronary artery bypass graft，CABG）術后再狹窄的主要方法，既可以研究靜脈橋的病理變化、發病機制，又可以用于檢驗干預措施是否有效[1]。本實驗應用大鼠為建模動物，以Cuff套管法為吻合方法，利用大鼠頸外靜脈作為橋血管，分別將頸外靜脈移植至頸總動脈和腹主動脈。建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型，將兩種模型的進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級SD大鼠30只，雌雄不限，體質量300～350g，購自南方醫科大學實驗動物中心。蘇木素染液、伊紅染液由南方醫科大學實驗室提供。二甲苯、中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠分為A組和B組，每組15只。均以右側頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，A組將頸外靜脈移植至右側頸總動脈，B組移植至腹主動脈，分別建成兩種自體靜脈再狹窄的動物模型。

1.2.2 模型建立 （1）A組模型建立：10%水合氯醛按300 mg／kg行腹腔注射麻醉。1%肝素按250U／kg腹腔注射予以全身肝素化。固定大鼠，取右側胸鎖乳突肌前切口，長約3.0 cm，逐層切開。充分顯露頸外靜脈，長約1.5cm。采用“no touch”技術游離右側頸總動脈約2.0cm，取右側頸外靜脈作靜脈橋，長度約1.5cm，兩斷端用8／0無損傷縫線結扎，用肝素、罌粟堿生理鹽水沖洗管腔。右側頸總動脈兩端以無損傷“哈巴狗”血管夾阻斷血流，中間縱行切開約0.7cm，并用肝素、罌粟堿生理鹽水沖洗管腔。用長約3.0mm動脈穿刺外鞘管（20 G，1.1mm）自制套管。將頸外靜脈兩端分別穿過套管，用眼科鑷夾住殘端兩部分翻轉于套管體部上，6-0號絲線結扎套管固定。靜脈橋制作完后放置于肝素、罌粟堿生理鹽水中。用顯微剪在動脈兩端中間剪開，助手用兩把眼科鑷子牽開動脈管壁輔助，將待移植的右側頸外靜脈上下顛倒后分別插入右側頸總動脈兩端，6-0絲線結扎固定，然后將結扎線與套管固定進一步防止滑脫。吻合完畢后依次開放遠近端動脈夾，靜脈橋充盈，觀察搏動良好。徹底止血，術野消毒后縫合皮膚。（2）B組模型建立：以同樣的方法將右側頸外靜脈移植至腹主動脈。所有大鼠術后第1天開始每只肌注青霉素鈉4萬U／d，用至術后5 d，給予阿司匹林10mg·kg-1·d-1灌胃抗凝。

1.2.3 標本采集 術后第1、2、4周分3次取材，每次每組隨機選取5只大鼠。大鼠麻醉后從原切口找到靜脈橋，觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。切取靜脈橋標本后處死大鼠。靜脈橋標本用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛沖洗固定，脫水，石蠟包埋，切片厚度為4μm。每條靜脈標本隨機選取不同位置的切片共5張，HE染色。

1.2.4 觀察指標 每只大鼠選取5張切片，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量內膜和中膜的厚度。每張切皮從3、6、9、12點鐘4個不同的位置測量，然后取平均值。

1.3 統計學處理 采用SAS 8.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

30只大鼠建模后全部成活。共30條橋靜脈均通暢，搏動良好。兩組大鼠手術時間、吻合時間比較 兩組大鼠手術過程順利，手術時間，見表1。B組手術時間、吻合時間均較A組長，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組大鼠術后不同時間橋靜脈切片HE染色，見圖1、2。不同時間內膜和中膜的厚度比較，見表2。兩組大鼠隨著術后時間的延長，內膜和中膜的厚度也逐漸增厚。B組大鼠在第1、2、4周不同的時間點，內膜和中膜的厚度分別與A組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 術后A組第1、2、4周靜脈橋切片HE染色（×400）

圖2 術后B組第1、2、4周靜脈橋切片HE染色（×400）

表1 A組與B組手術和吻合時間比較（±s，min）

表1 A組與B組手術和吻合時間比較（±s，min）

＊：P＜0.05，與A組比較。

15 40.5±3.3 17.9±3.1 B組 15 49.1±3.3＊ 23.4±2.8手術時間 吻合時間A組組別 n＊

表2 A組與B組大鼠術后不同時間橋靜脈內膜和中膜的厚度比較（±s，μm）

表2 A組與B組大鼠術后不同時間橋靜脈內膜和中膜的厚度比較（±s，μm）

組別 n 管壁厚度 第1周 第2周 第4周19.0±1.5 41.2±1.9 59.8±1.9中膜厚度 17.4±1.1 37.6±1.1 51.6±2.4 B組 15 內膜厚度 18.6±1.3 40.8±2.2 59.4±1.9中膜厚度A組 15 內膜厚度17.6±1.4 37.0±1.0 51.6±1.8

3 討 論

作為治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要方法之一，迄今CABG已歷經40余年的臨床時間，尤其適用于多個危險因素的患者[2]。乳內動脈，尤其是做乳內動脈由于其解剖位置的優勢和長期的通暢率，一直以來都作為CABG術中前降支搭橋的最佳橋血管。但是在乳內動脈條件較差時，大隱靜脈仍然是首選的橋血管。長期以來使其在CABG中得到了廣泛的應用[3]。

隨訪資料顯示，乳內動脈吻合前降支，1年通暢率達95.7%，10年通暢率在90.0%以上[4]，明顯優于大隱靜脈。研究表明，大隱靜脈1年內可能發生靜脈吻合口近端狹窄、血栓形成，1年、5年的通暢率分別為93.0%、74.0%。10年通暢率在50.0%～60.0%[5]，長期效果明顯不如乳內動脈。靜脈橋的再狹窄大大降低了手術的遠期效果，對于再狹窄的發生機制仍有許多不明之處，目前認為再狹窄可能與大隱靜脈游離過程中的損傷，術后血流動力學的改變以及炎癥因子釋放等一系列變化，術后新生內膜增生、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖、遷移所造成的血管重塑共同作用的結果[6]。術后較高的再狹窄發生率已經成為影響自體靜脈在CABG術后中遠期療效最主要的限制因素[7]。

3.1 建立靜脈橋再狹窄動物模型的現狀 靜脈移植動物模型是研究CABG術后再狹窄的主要方法，既可以研究靜脈橋的病理變化、發病機制，又可以用于檢驗干預措施是否有效。目前，研究移植靜脈橋再狹窄的動物模型有豬、犬等大動物，也有大鼠、兔子等小動物。大動物操作相對簡單，但所需費用較高。小動物價格便宜，易于飼養及管理。但由于其血管直徑小，吻合操作困難，需要具備血管吻合相關技能的人員操作。實驗性自體靜脈移植模型多種多樣，血管橋主要為頸外靜脈和大隱靜脈，移植部位多在頸動脈、腹主動脈或股動脈。有研究表明，移植物早期再狹窄的主要原因是吻合技術和血栓形成[8]。在靜脈橋再狹窄模型的建立過程中血管吻合方法主要有連續縫合、間斷縫合和Cuff套管法[9]。目前，國內外研究再狹窄的動物模型中關于大鼠血管移植模型的報道相對較少，主要是采用顯微外科縫合方法。因其需要精巧的纖維外科技術和很高的外科基本功，手術中操作空間小，常常因血管暴露不清造成誤縫或管壁撕裂，而導致吻合口出血和狹窄。因此，改進靜脈移植模型，提高近期通暢率，減少手術操作本身對血管的損傷對延長大鼠術后存活時間十分必要。大鼠價格低廉，Cuff套管法建立頸外靜脈移植到頸總動脈模型，操作簡單，成功率高。該模型能真實地模擬靜脈橋旁路移植至動脈環境術后靜脈橋再狹窄的病理過程，是進一步研究防治靜脈再狹窄的理想模型，有利于開展大規模的動物實驗。此模型是研究移植靜脈內膜增生和狹窄的發病機制、病理變化及探討其防治促使的理想動物模型。本研究利用大鼠頸外靜脈作為橋血管，分別將頸外靜脈移植至頸總動脈和腹主動脈，建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型，將兩種模型的進行對比研究。兩種模型均為目前動物實驗中能反映CABG術后移植靜脈再狹窄病理過程所用的理想模型。設計制作一種簡單易行的移植血管再狹窄模型具有重要的實際意義。

3.2 選擇頸總動脈為移植部位的優點 排除技術的干擾，盡管兩種動物模型的建立同樣能達到預期的效果。但髂動脈和腹主動脈的吻合由于需要進入腹腔，對動物創傷較大，并發癥多，死亡率高。在供受血管選擇中，由于頸外靜脈解剖位置比較固定，便于尋找，且易于顯露游離，且移除單側靜脈對動物的全身影響較小。另外，頸總動脈距離心臟較近，動脈壓力較高，對移植靜脈內膜損傷較大，易于更加真實地模擬CABG的病理生理變化。

3.3 Cuff套管技術的優點 縫合法在收緊縫線時易造成管口的狹窄，又易于縫至對側，手術具有較大難度。目前，采用小動物建立模型的過程中血管的吻合方式逐漸發展為套管法，并且收到較好的效果[10-11]。本研究認為，Cuff套管法較間斷縫合和連續縫合法操作簡單，并且無需顯微外科縫合，對手術者外科技術影響較小。一般不存在吻合口漏血情況，成功率較高。且因吻合口口徑大小一致，對內膜損傷和血管剪切應力小，通暢率高，手術時間也明顯縮短，Cuff套管法和縫合法吻合血管均能真實反映CABG術后靜脈橋再狹窄的情況，但前者更加簡單。是進一步探尋CABG術后橋血管再狹窄病因和機制的理想模型。隨著Cuff套管技術的出現其在動物模型建立過程中的廣泛應用。使血管移植模型的建立和推廣日漸可行。原裝進口Cuff套管價格昂貴，國內購買定制存在較大困難。本實驗所采用Cuff套管利用臨床上較為常用的BD公司的動脈留置針套管（20G，1.1mm）制成。其材料易于獲得，又有一定的韌性，但又不過于堅硬，其管徑與大鼠的頸外靜脈和頸總動脈基本吻合實驗可用性強。自制的Cuff管遠端可留一柄利于夾持，翻轉時不易造成損傷。實驗動物中均未觀察到自制的套管有明顯的異物反應，亦未見刺激局部血栓形成的現象。

3.4 本實驗模型建立過程中的注意事項 顯露腹主動脈時，將胃和腸道用鹽水紗布包裹并向腹腔兩側推開即可達到良好顯露效果，動作要輕柔。切記操作過程粗暴，或將胃和腸道拉出擺放在腹腔外，以免損傷腸管。關腹時腹腔內注入少量生理鹽水使腸管漂起，輕揉兩側腹壁即可使腸管復位，防止術后發生腸扭轉及腸梗阻的發生。分離動、靜脈時采用“no touch”技術，盡量減少血管壁的損傷。分離頸總動脈時要避免損傷迷走神經和氣管旁的小動脈。動脈分離完畢時，滴少于罌粟堿防止血管痙攣。下腔靜脈緊鄰腹主動脈，在分離下腔靜脈與腹主動脈時，要盡量避免損傷血管壁，尤其要避免損傷下腔靜脈，否則會出現致命性的出血獲取靜脈橋后要用肝素水反復沖洗干凈，預防血栓形成。Cuff套管中間可作一切跡，以防止血管橋滑脫套管翻轉時。開放靜脈橋時，應先開放遠端并排氣，再開放近端，以防止氣體栓塞，從而提高動物成活率。為了避免移植靜脈血管出現扭曲，可在一端動靜脈口吻合完畢后，短暫開放此端動脈夾使靜脈橋血管輕度充盈以使靜脈自然伸直。

綜上所述，Cuff套管法建立大鼠頸外靜脈移植到頸總動脈模型，操作簡單，成功率高，無近期免疫排斥反應，有利于開展大規模的動物實驗。兩種模型均是研究移植靜脈增生和狹窄的發病機制、病理變化及防治措施的理想的動物模型。

[1] Schachner T，Laufer G.Bonatti J.In vivo（animal）models of vein graft disease[J].Eur J Cardiothorac Surg，2006，30（3）：451-463.

[2] Marui A，Okabayashi H，Komiya T，et al.Benefits of Offpump coronary artery bypass grafting in high-risk patients[J].Circulation，2012，126（1）：S151-S157.

[3] Tsakok M，Taylor SM，Tsakok T.Storage of saphenous vein grafts prior to coronary artery bypass grafting：is autologous whole blood more effective than saline in preserving graft function[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg，2012，15（4）：720-725.

[4] Lawrie GM，Morris GC Jr，Earle N.Long-term results of coronary artery bypass surgery：Analysis of 1698Patients followed 15to 20years[J].Ann Surg，1991，213（5）：337-385.

[5] Gao CQ，Liu ZY，Li BJ，et al.Comparison of graft patency for off-pump and conventional coronary arterial bypass grafting using 64-slice multidetector spiral computed tomography angiography[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg，2009，8（3）：325-329.

[6] Peykar S，Angiolillo DJ，Bass TA，et al.Saphenous vein graft disease[J].Minerva Cardioangiologica，2004，52（5）：379-390.

[7] Qiao A，Zeng Y，Xu X.Comparisons of hemodynamics in 1-way and 2-way CABG[J].J Biomed Eng，2006，23（2）：295-299.

[8] 肖雅瓊，孫宗全，張凱倫，等.大鼠自體頸外靜脈移植模型的建立與改進[J].華中科技大學學報：醫學版，2010，39（1）：106-108.

[9] Kloppenburg GT，de Graaf R，Grauls GE，et al.Chlamydia pneumonia aggravates vein graft intimal hyperplasia in a rat model[J].BMC Microbiol，2007，7：111.

[10] Zou Y，Dietrich H，Hu Y，et al.Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis[J].Am J Patho，1998，153（4）：1301-1310.

[11] Mizuta T，Nakahara K，Shirakura R，et al.Total no-microsuture technique for rat lung transplantation[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1991，102（1）：159-160.