人宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞水平和生物學特性的比較研究＊

董 超，金從國，吳星嬈，楊 毅，高碧燕

（昆明醫科大學第三附屬醫院／云南省腫瘤醫院：1.腫瘤內二科；2.腫瘤研究所；3.放射治療研究中心；4.婦瘤科，昆明650118）

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居女性惡性腫瘤第2位，容易復發與轉移，單純的手術切除或手術加放化療并不能從根本上解決宮頸癌復發和轉移。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）是一類存量較少，同時具有腫瘤細胞和干細胞特征的干細胞樣癌細胞亞群，在腫瘤生長、復發和轉移中均起關鍵作用。研究表明，多種惡性腫瘤的側群（side population，SP）細胞富集于CSC，可以作為干細胞研究的重要資源[1]。本研究采用Altra流式細胞儀分選出人宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞，比較兩組SP細胞的生物學標記和細胞周期增殖凋亡的狀況，探討以側群細胞作為宮頸癌干細胞研究切入點的可行性和科學依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）標本來源：選取2010年6月至2012年6月在本院婦瘤科經宮頸活檢確診的宮頸癌標本60例（均經患者或委托人知情同意），病理類型均為鱗癌，其中年齡33～73歲，平均50.4歲。宮頸癌分期和病理分級采用國際婦產科聯盟的標準（FIGO，2009年），其中ⅠB2期7例，ⅡA期8例，ⅡB期29例，ⅢB期16例，臨床及病理資料完整。Hela細胞株來自上海細胞庫。（2）實驗試劑：DMEM／F 121∶1培養基購自Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液購自Solarbio公司，碘化丙咤（PI）、維拉帕米（verapamil hydrochloride）、Hoechst 33342、二甲基亞砜 （DMSO）、四甲基噻唑藍（MTT）和膠原酶Ⅰ購自Sigma-Aldrich公司，磷酸鹽緩沖液 （PBS）購自貝博生物公司。ABCG2-PE、CD133-PE、CD43-PE、P63-PE、Ki67-PE、MDR-PE抗體均購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 人宮頸癌細胞原代培養及細胞傳代 在新鮮腫瘤組織邊緣無壞死、鈣化及電凝部位無菌取材，將組織置入含青霉素（100 000U／L），鏈霉素（100 000mg／L）的無血清 RPMI-1640培養基內，并于1h內處理，組織塊置于培養皿中，加入RPMI-1640液，再用RPMI-1640液漂洗2次后剪成約1mm×1mm×1mm，加入0.25%胰蛋白酶消化液置于37℃消化20～30min，細胞懸液紗布過濾后1 000r／min，5min離心，棄上清液，稀釋成105個／mL濃度，用含10%FBS的RPMI1640培養液稀釋，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫箱中培養，每2～3天換液并傳代1次，以0.02%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）和0.25%胰蛋白酶的1∶1混合液消化，經6次傳代選用對數生長期細胞為實驗對象。

1.2.2 宮頸癌Hela細胞株的培養和傳代 含10%FBS，100 U／mL青霉素，100U／mL鏈霉素的 RPMI-1640培養液為完全培養基，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養。顯微鏡下觀察到細胞貼壁生長，用無菌0.9%生理鹽水清洗2次，加入含血清的RPMI-1640培養液培養。顯微鏡下觀察到細胞貼壁長滿，倒除培養液，用無菌0.9%生理鹽水清洗2次，以0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶的1∶1混合液2mL消化。顯微鏡下觀察到貼壁細胞已完全消化下，加入含10%血清的RPMI-1640培養液2mL終止消化，輕輕吹打成單細胞懸液，移一半細胞懸液至新培養瓶中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。

1.2.3 細胞染色 選用對數生長期細胞，PBS洗1次，加入EDTA-2Na和胰蛋白酶混合消化液2mL，鏡下觀察細胞變圓，加入含血清培養基中止消化，脫壁形成細胞懸液，移入無菌離心管，以1 000r／min離心10min，棄上清液，用含10%FBS的RPMI-1640培養液稀釋成以106個／mL濃度的細胞懸液。細胞分為2組，各1mL，一組加入5μL Hoechst33342；二組加入5μL Hoechst33342及200μL維拉帕米。將2組細胞置于37℃恒溫水浴振蕩120min，每15分鐘手動振蕩1次。2h后取出，加入冰PBS終止反應，以1 000r／min離心10min，棄上清液。再加入冰PBS液，尖吸管吹打，混勻。2組分別加入PI至終濃度2μg／mL，立即用流式細胞儀分析。

1.2.4 Altra流式細胞儀分析SP亞群 待分選細胞用5～10 μg／mL的Hoechest33342標記，置于37℃中搖床振蕩90～120min，用流式細胞儀進行分析和分組，Hoechst33342的激發光為407nm紫光，450／40帶通收集藍光，695／40帶通收集紅光。PI的激發光為488nm藍光，用575／26帶通收集紅光。收集分選出的SP細胞懸液，離心半徑6cm、1 500r／min離心10min，棄上清液，各加至1mL，制成單細胞懸液，各設實驗管和對照管，每管細胞數1×106個，實驗管中加入ABCG2-PE、CD133-PE、CD43-PE、P63-PE、、Ki67-PE、MDR-PE各20μL，對照管中不加，混勻，室溫下避光靜置2h，用流式細胞儀檢測各個管中抗體陽性表達率。

1.2.5 流式細胞儀TUNEL法檢測SP細胞的細胞周期時相分布和細胞凋亡 分別收集宮頸癌組織原代培養6代細胞和Hela細胞株中8×106個SP細胞，加入500μL預冷70%的乙醇重懸，冰上固定30min后離心細胞。同一樣品分為2管，分別加入TDT反應液及陰性對照液各30μL，放置在37℃下，孵育1h；加入1mL含0.2%BSA的PBS洗滌，700r／min室溫離心3min；去上清液，加入10mg／mL RANse 20μL、0.1%Triton 200μL，放置在37℃下，孵育15min；加入100μg／mL的PI染液1mL，避光放置15～30min。流式細胞儀進行細胞周期分析和凋亡檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，成組資料采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP含量的測定 采用Altra流式細胞儀分選出宮頸癌組織原代培養6代細胞和Hela細胞株中SP細胞的水平分別為（1.62±0.48）%和（2.70±0.59）%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、2，表1。

圖1 宮頸癌組織SP細胞水平

表1 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞含量及其生物學特性比較（±s，%）

表1 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞含量及其生物學特性比較（±s，%）

項目 宮頸癌組織（n＝60）Hela細胞株（n＝30）t P SP細胞含量1.62±0.48 2.70±0.59 9.316 0.000 ABCG2 78.59±5.42 80.17±3.60 1.443 0.152 CD133 51.55±6.29 52.87±4.96 1.005 0.318 CD43 69.73±5.70 70.68±5.44 0.756 0.452

續表1 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞含量及其生物學特性比較（±s，%）

續表1 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞含量及其生物學特性比較（±s，%）

項目 宮頸癌組織（n＝60）Hela細胞株（n＝30）t P P63 47.56±6.92 48.06±5.28 0.348 0.729 Ki-67 14.69±1.69 15.33±1.38 1.810 0.074 MDR 58.36±11.12 58.24±5.32 0.057 0.955

圖2 Hela細胞株SP細胞水平

2.2 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞的生物學特性比較 SP細胞的各項生物學標記（ABCG2、CD133、CD43、P63、Ki-67、MDR）在宮頸癌組織和Hela細胞株中的表達無統計學差異（P＞0.05），見表1。

2.3 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞的細胞周期和細胞凋亡比較 SP細胞在宮頸癌組織和Hela細胞株中各細胞周期時相分布（G0／G1、S、G2／M 期）和細胞凋亡壞死的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表2，圖3～6。

表2 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP的細胞周期和細胞凋亡比較（±s，%）

表2 宮頸癌組織和Hela細胞株中SP的細胞周期和細胞凋亡比較（±s，%）

生物學特性 宮頸癌組織（n＝60）Hela細胞株（n＝30）t P 94.70±1.76 95.10±1.59 1.046 0.299 S 3.25±0.99 2.92±0.84 1.540 0.127 G2／M 2.05±1.10 1.98±0.95 0.312 0.756凋亡 4.06±0.64 3.92±0.59 0.967 0.336壞死G0／G1 1.00±0.38 1.12±0.31 1.504 0.136

圖3 宮頸癌組織SP細胞周期

圖4 Hela細胞株中SP的細胞周期

圖5 宮頸癌組織SP細胞凋亡壞死

圖6 Hela細胞株中SP的細胞凋亡壞死

3 討 論

目前，對CSC的研究仍處于探索階段，對大多數腫瘤而言，迄今仍未建立較特異的分選鑒定方法，從形態學上很難區分CSC與腫瘤細胞間的差異，只能用功能學方法即從自我更新能力和分化潛力來鑒定CSC。分離CSC主要有：SP細胞分選、無血清培養富集干細胞和通過CSC表面特異性標志篩選3種方法[2]。SP法是利用SP細胞外排染料Hoechst33342的特征，采用流式細胞技術將染色陰性和弱陽性的細胞分選出來，分離正常干細胞和CSC。目前，尚未發現CSC特異性標志與正常組織干細胞之間有何區分，公認的是根據共有的生物學特性進行鑒定，如自我更新能力、表達干細胞標志、耐藥基因表達和免疫缺陷鼠體內成瘤等[3]。CSC理論認為并非所有腫瘤均具有無限增殖和自我更新的能力，腫瘤細胞中存在一些數量很少但具有類似于干細胞功能的細胞，他們具備上述CSC特性，無論經過手術還是放療和化療等各種治療的癌癥患者，理論上只要還存在CSC就可能出現腫瘤的復發和轉移[4]。

本實驗采用Altra流式細胞儀成功分選出60例不同分期的宮頸癌組織和Hela細胞株中的SP細胞。宮頸癌組織進行原代培養6代細胞分選出SP細胞的水平為（1.62±0.48）%，較國內學者的結果略低[5]；Hela細胞株中的SP細胞水平為（2.70±0.59）%，較其他學者的結果略高[6]；與同實驗中 SP細胞比較，人宮頸癌組織SP水平明顯低于Hela細胞株，差異有統計學意義（P＜0.05）。多項研究表明，實體瘤中SP細胞具有CSC特性，即表達干細胞相關表面標志，具有自我更新、致瘤能力強和高表達轉運蛋白ABCG2等，ABCG2是ATP結合盒藥物轉運子家族成員之一的基因，是通過水解ATP供能將化療藥物泵出胞外，導致細胞耐藥，這也是腫瘤耐藥、復發的重要原因之一[7-8]。在宮頸癌組織和Hela細胞株SP細胞ABCG2呈高水平表達（78.59±5.42）% 和（80.17±3.60）%，提示ABCG2可能是參與維持腫瘤多藥耐藥性的一個重要生物標志[9-10]。Ki-67抗原為人增殖期細胞特異性核蛋白，在不同病理分級的侵襲性鱗癌中均有表達，而且表達水平與腫瘤細胞增生密切相關，與宮頸癌分期成正相關[11]。宮頸癌組織和Hela細胞株中SP細胞的Ki-67的表達率分別為（14.69±1.69）%和（15.33±1.38）%，明顯低于其他生物學標記物的表達，提示兩種組織來源的SP細胞具有CSC的相對靜止、低增殖和低凋亡的特征。研究顯示，P63基因對于正常上皮的發育和維持其功能起關鍵作用，在調節干細胞的一致性上有重要的作用，并在皮膚、肺、宮頸和其他部位的鱗狀上皮的分化過程中擔當操縱子，P63優先表達于宮頸儲備細胞的胞核中，隨腫瘤惡性度而升高，可能是宮頸癌干細胞的標記物[12]。本實驗中宮頸癌和Hela細胞株中SP細胞中P63的表達率分別為（47.56±6.92）%和（48.06±5.28）%，差異無統計學意義（P＞0.05）。SP細胞在宮頸癌組織和Hela細胞株處于G0／G1期比例最多，高達（94.70±1.76）%和（95.10±1.59）%，提示SP細胞主要處于靜止期，而凋亡和壞死比例較低。在宮頸癌組織和 Hela細胞株的凋亡表達率為（4.06±0.64）%和（3.92±0.59）%；壞死表達率為（1.00±0.38）%和（1.12±0.31）%。進一步證實SP細胞具有CSC的相對靜止、低增殖和低凋亡的特征。SP細胞具有CSC的特性，可用于鑒定CSC[13-14]。本研究立足于CSC學說，應用流式細胞技術對宮頸癌組織和Hela細胞株進行SP細胞的分離、生物學標記、細胞周期、細胞凋亡和壞死的檢測，確定了宮頸癌組織和Hela細胞株的SP細胞均具有CSC特性。

綜上所述，本研究認為人宮頸癌組織和Hela細胞株中的SP亞群細胞富集于宮頸癌干細胞，通過流式細胞儀分選SP細胞亞群是分離宮頸癌干細胞的一種有效方法，無論人宮頸癌組織還是Hela細胞株中的SP細胞均可作為宮頸癌干細胞篩選和研究的切入點，這也為進一步研究宮頸癌干細胞的特異性標記奠定了實驗基礎[5，15]。本研究選用宮頸癌原代培養細胞作為研究對象，為研究宮頸癌化療、放療、分子靶向等個體化治療策略提供一定理論基礎和科學依據。

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