大鼠肢體缺血再灌注急性肺損傷細胞自噬及其相關蛋白的表達

李躍兵，康于慶，葉 靖，趙振龍，林春水，秦再生，古妙寧△

（1.南方醫科大學附屬南方醫院麻醉科，廣州510515；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院麻醉科，杭州310005）

肢體缺血再灌注（limb ischemia-reperfusion，LIR）在臨床外科中較常見，如動脈損傷或栓塞后再通、斷肢再植、肢體創傷及止血帶的長時間應用等；特別是在地震災難中，肢體缺血損傷的致死、致殘率非常高，值得關注。挽救缺血肢體的關鍵是盡快恢復血液循環，但大量研究證明，LIR不僅影響局部缺血組織的存活和功能，還可造成全身炎癥反應綜合征（SIRS），并可能導致多臟器功能衰竭（MODS），其中肺是最易受損的器官之一，易造成急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。近年來人們對LIR所致ALI的機制研究多集中在損傷與氧化應激方面，凋亡、壞死被認為是缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I／R）組織細胞的病理結局[2-5]。但隨著研究的深入，自噬被認為能夠被各種損傷及氧化應激等誘發[6-8]。本研究旨在觀察大鼠LIR-ALI肺組織細胞早期自噬及其相關蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性SPF級SD大鼠12只，體質量220～250g，由南方醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（粵）2011-0015]。所有動物飼養和實驗操作程序符合南方醫科大學實驗動物福利倫理委員會相關規定，并經南方醫科大學動物倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器 Trizol（Invitrogen公司）、第1鏈cDNA的合成試劑盒（TaKaRa公司）、SYBR實時熒光定量PCR（RTPCR）試劑盒（TaKaRa公司）、RT-PCR逆轉錄試劑盒（Invitrogen公司產品）、GDS7600（DF-23B）凝膠掃描系統（英國UVP公司）、Stratagene Mx3000PReal time PCR儀（美國Agilent公司）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 采用大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h制備LIR-ALI模型。實驗前大鼠在實驗室適應性飼養1d，術前禁食12h，自由飲水，實驗前2h禁水。隨機數字表法分為假手術（Sham）組及I／R組，每組6只。稱質量后大鼠3%戊巴比妥鈉（首劑40mg／kg，維持劑量20mg／kg）腹腔注射麻醉后固定于動物手術臺上。Sham組僅雙側股三角處切開皮膚，分離出股動脈，絲線標記不結扎，縫合創口。I／R組分離出股動脈后，于近腹股溝韌帶處用無創微動脈夾夾閉股動脈使雙下肢缺血，縫合創口再以適度松緊的橡皮帶環繞結扎雙下肢根部以防側支循環，以捫不到足背動脈搏動、雙足變暗變涼為缺血成功的標志；3h后打開原切口，去除動脈夾恢復雙下肢血流再灌注4 h，動脈搏動恢復及雙足逐漸變紅變暖為建立LIR模型成功。

1.3.2 觀察指標 （1）再灌注4h末即刻剖開胸腔，直視下經心尖部穿刺抽取3～4mL全血，4℃、3 000r／min離心10min后取上清液，置于-70℃凍存待測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），并放血處死大鼠。（2）取雙肺組織，4℃的冰0.9%NaCl溶液浸泡，肺變白后取下左肺放置于4%的多聚甲醛固定24h以上，石蠟包埋后切片行免疫熒光染色測量，采用盲法由專科醫師在倒置熒光顯微鏡下閱片，觀察肺組織免疫熒光特異性標記抗體的表達，并利用Image J2x軟件進行免疫熒光強度分析。（3）利用RT-PCR法檢測各組肺組織Beclin1和自噬相關基因（autophagy related genes，ATG）5mRNA表達：取右側肺組織100mg，采用Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉錄反應合成cDNA，然后采用PCR儀進行擴增。引物序列如下 GAPDH 正向引物：5′-CCT CGT CTC ATA GAC AAG ATG GT-3′，反向引物：5′-GGG TAG AGT CAT ACT GGA ACA TG-3′；Beclin1正向引物：5′-GGG GCC TAA AGA ATG GAG GG-3′，反向引物：5′-CGT GTC CAG TTT CAG AGG CT-3′；ATG5正向引物：5′-ACT GAA CGA GAA GCA GAG CC-3′，反向引物：5′-TGT TCC AAG GCA GAG CTG AG-3′，引物是由Invitrogen公司合成。PCR反應條件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40個循環，用 Agilent Stratagene RT-PCR儀Mx3000P進行RT-PCR實驗，測定Beclin1和ATG5mRNA的表達定量。（4）蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測LC3蛋白表達：取下剩余右側肺組織100mg，-80℃保存，Western blot測量肺組織LC3蛋白含量，并計算LC3-Ⅱ／GAPDH的蛋白含量比值。目的蛋白采用SDS-PAGE，轉膜結束后，取出PVDF膜和凝膠，將凝膠用靠馬斯亮藍染色觀察轉移效率；將PVDF膜分別放入裝有3mL抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ抗體中，洗膜后再放入含有3mL辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，1%BSA-TBS 1∶5 000稀釋；最后進行化學發光、顯影及定影，將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析條帶凈光密度值。

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，并做方差齊性檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠血清LDH測定 血清LDH Sham組為（2.35±0.01）U／L，I／R組為（6.66±0.03）U／L，兩組比較差異有統計學意義（t＝119.242，P＝0.000）；I／R組血清LDH 的活性顯著升高，提示大鼠LIR-ALI模型制備成功。

2.2 肺組織免疫熒光病理變化及特異性標記抗體表達 免疫熒光染色鏡下Sham組可見正常肺組織且結構清晰，而I／R組肺組織結構紊亂且肺泡壁增厚；免疫熒光強度值Sham組為5.54±0.09，I／R組為9.58±0.21，兩組比較差異有統計學意義（t＝17.979，P＝0.000）；I／R組的肺組織免疫熒光特異性標記抗體高表達，見圖1。

圖1 兩組大鼠的肺組織免疫熒光圖（×10）

2.3 肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達 I／R組與Sham組Beclin1和 ATG5mRNA 2-△△CT比值分別為12.72±0.13、18.34±0.08，兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達結果（±s）

表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達結果（±s）

?

續表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達結果（±s）

續表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達結果（±s）

2-△△CT：I／R組目的基因表達相對于Sham組的變化倍數；＊＊：P＜0.01，與Sham組比較。

組別 ATG5CT GAPDH CT △CT（Avg.ATG5CT-Avg.GAPDH CT） △△CT（Avg.△CT-Avg.△CT mean） 2-△△CT Sham組 28.68±0.06 18.96±0.07 9.72±0.09 0.00±0.09 1.00±0.09 I／R組 24.61±0.05 19.08±0.06 5.53±0.08 -4.20±0.08 18.34±0.08＊＊

2.4 Western blot法檢測LC3蛋白含量及LC3-Ⅱ／GAPDH比值 LC3-Ⅰ蛋白含量凈光密度值Sham組1 699.646±20.761，I／R組6 707.375±42.641，兩組比較差異有統計學意義（t＝105.590，P＜0.01）；LC3-Ⅱ蛋白含量凈光密度值Sham組5 783.733±53.297，I／R組12 961.459±204.518，兩組比較差異有統計學意義（t＝33.962，P＜0.01）；GAPDH 蛋白含量凈 光 密 度 值 Sham 組 7 631.270±45.566，I／R 組7 531.818±8.651，兩組比較差異無統計學意義（t＝2.144，P＞0.05）；LC3-Ⅱ／GAPDH比值，Sham組0.758±0.007，I／R組1.721±0.027，兩組比較差異有統計學意義（t＝34.130，P＜0.01），見圖2、3。

圖2 兩組大鼠的肺組織LC3蛋白Western blot結果

圖3 兩組大鼠的肺組織LC3蛋白水平

3 討 論

自噬與凋亡的關系是生命科學研究的一個熱點，雖然自噬在除肺組織以外的臟器系統中研究取得了較大進步，但有關LIR-ALI與自噬方面的相關研究甚少[9]。自噬為真核細胞所特有，是細胞內的物質成分利用溶酶體被降解過程的統稱。細胞對內外環境壓力變化如發育、衰老、損傷、缺血缺氧等可誘發自噬，在某些情況下還可導致細胞死亡。自噬被認為是區別于細胞凋亡的另一種細胞程序性死亡形式，前者屬Ⅰ型，后者為Ⅱ型[10]。

有研究認為，常溫下肌肉骨骼肌是肢體最易缺血的組織，僅可耐受缺血4h[11]。肢體I／R可引起氧化應激導致肺血管細胞損傷，而自噬可能是該類損傷的一種可誘導的適應性反應。自噬的發生需要眾多關鍵ATG的參與，其中ATG12和ATG5結合形成自噬體前體，他們的高表達促進自噬的激活[12]。本研究中，大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h引起了肺組織免疫熒光染色特異性標記抗體的高表達，而用半定量RTPCR法測定Beclin1和ATG5mRNA相對表達量亦增高，促進了自噬的激活。

目前測量自噬的作用途徑大致分為3類：顯微鏡檢查、靜態生化測量（如 Western blot）、動態生化測量。其中，免疫熒光染色法能更好地檢測各個時期的自噬小體，而自噬最多的檢測方法是利用 Western blot檢測LC3[13]。

LC3-Ⅰ／Ⅱ和Beclin1是兩個重要的自噬相關分子，被廣泛地用來研究自噬的發生、發展。LC3是自噬體的標志性蛋白，當自噬被誘導，細胞質中的LC3前體通過蛋白水解轉化成LC3-Ⅰ，再進一步轉化成磷脂酰乙醇胺結合的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被認為是自噬性細胞死亡的特異性分子標志物[13]。特別是LC3-Ⅱ含量的多少與自噬泡數量的多少呈正比，因此可以根據LC3的水平來推測自噬作用的大小。在肺血管細胞中，炎性標志物高表達引發自噬，LC3-Ⅰ轉化增加并聚集，自噬量進一步增加，從而引起肺支氣管上皮細胞死亡及組織損傷[14]。本研究中大鼠 LIR-ALI模型 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ／GAPDH均增高，說明LIR-ALI導致肺組織自噬上調。

綜上所述，LIR-ALI可誘導自噬發生并促其相關蛋白高表達，本研究為進一步明確LIR-ALI與自噬的發病機制奠定了基礎。筆者將利用該抑制劑和激活劑進一步研究LIR-ALI的作用機制及臨床藥物／技術對其干預效果。

[1] 孫曉峰，王俊科，楊軍，等.辛伐他汀對肢體缺血再灌注肺損傷大鼠肺組織中NF-κB及ICAM-1表達的影響[J].南方醫科大學學報，2011，31（7）：1150-1153.

[2] Dorweiler B，Pruefer D，Andrasi T，et al.Ischemia-reperfusion injury[J].Eur J Trauma Emerg Surg，2007，33：600-612.

[3] Murphy E，Steenbergen C.Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury [J].Physiol Rev，2008，88（2）：581-609.

[4] Men X，Han S，Gao J，et al.Taurine protects against lung damage following limb ischemia repefusion in the rat by attenuating endo-plasmic reticulum stress-induced apoptosis[J].Acta Orthop，2010，81（2）：265-269.

[5] Iwata A，Morgan-Stevenson V，Schwartz B，et al.Extracellular BCL2proteins are danger-associated molecular patterns that reduce tissue damage in murine models of ischemia-reperfusion injury [J].PLoS One，2010，5（2）：e9103.

[6] Scherz-Shouval R，Elazar Z.Regulation of autophagy by ROS：physiology and pathology[J].Trends Biochem Sci，2011，36（1）：30-38.

[7] Qin AP，Liu CF，Qin YY，et al.Autophagy was activated in injured astrocytes and mildly decreased cell survival following glucose and oxygen deprivation and focal cerebral ischemia[J].Autophagy，2010，6（6）：738-753.

[8] Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell，2008，132（1）：27-42.

[9] Nakahira K，Choi AM.Autophagy：apotential therapeutic target in lung diseases[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，305（2）：L93-107.

[10] 王云，沈健，許永華，等.血紅素加氧酶1誘導自噬減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷[J].中華消化外科雜志，2013，12（7）：538-543.

[11] Pak O，Aldashev A，Welsh D，et al.The effects of hypoxia on the cells of the pulmonary vasculature[J].Eur Respir J，2007，30（2）：364-372.

[12] Klionsky DJ，Abeliovich H，Agostinis P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes[J].Autophagy，2008，8（4）：151-175.

[13] Chen ZH，Kim HP，Sciurba FC，et al.Egr-1regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease[J].PLoS One，2008，3（10）：e3316.

[14] Kim HP，Wang X，Chen ZH，et al.Autophagic proteins regulate cigarette smoke-induced apoptosis：Protective role of heme oxygenase-1[J].Autophagy，2008，4（7）：887-895.