蘭州百合高效再生體系的建立

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（1酒泉職業技術學院生物工程系，甘肅酒泉 735000；2甘肅省農業科學院林果花卉研究所，甘肅蘭州733000）

蘭州百合高效再生體系的建立

崔興林1秦新惠1*劉 芬2伊萬偉1

（1酒泉職業技術學院生物工程系，甘肅酒泉 735000；2甘肅省農業科學院林果花卉研究所，甘肅蘭州733000）

以蘭州百合新鮮鱗片為試材進行高效再生體系的研究。結果表明：蘭州百合中層、內層鱗片比外層鱗片容易再生不定芽，更適于作為外植體。鱗片在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的誘導培養基上再生頻率最高，可達90%；不定芽在MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA的增殖培養基上增殖率最高，平均每芽新增芽4.5個；不定芽在MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC的壯苗生根培養基上鱗莖的膨大倍數最高，生根數量較多，小苗長勢優，移栽后成活率達98%以上。

蘭州百合；NAA；6-BA；再生體系

蘭州百合〔Lilium．davidii Duch. var. unicolor（Hoog）Cotton〕為百合科百合屬，其鱗莖碩大、潔白如玉、包合緊密、鱗片肥厚、粗纖維少、嚼之無渣，具有很高的食用價值，在西北地區產量高、品質佳，已成為全國知名品牌。蘭州地區約有150年的百合栽植歷史，主要分布在蘭州市南郊的二陰山區。目前，由于長期無性繁殖導致病毒病日趨嚴重，蘭州百合種性退化，生長周期長，品質和產量下降，亟須進行品種改良。建立穩定的高效離體再生體系是實現蘭州百合品種改良的基礎和前提（韓華麗和郭成金，2009；劉靜，2011），本試驗利用蘭州百合鱗片誘導分化不定芽，進行繼代培養，探討生長調節物質及活性炭對蘭州百合鱗片再生、不定芽增殖及鱗莖膨大生根的影響，以期建立蘭州百合高效離體再生體系。

1 材料與方法

試驗于2012年6月至2013年11月在酒泉市高科技農業示范園開展。

1.1 材料

試驗材料為外形飽滿、顏色潔白、健壯無病蟲害的3 a生蘭州百合鱗莖。剝去外層有創傷或帶有褐色小點的鱗片，剝取鱗片的外兩層、內兩層、中層，沖洗干凈，做好標記，用濾紙吸干水分后分別在3～5 ℃低溫條件下預處理5～7 d，再用70%酒精浸潤滅菌30 s，0.2%升汞溶液滅菌8 min，無菌水沖洗后用濾紙吸干水分，切成5 mm×5 mm的小塊，作為誘導培養的外植體。

1.2 方法

1.2.1 細胞分裂素與生長素對鱗片再生的影響 以MS為基礎培養基，加入30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，添加不同比例的細胞分裂素（6-BA）和生長素（NAA），誘導鱗片再生不定芽。6-BA的濃度分別為0.5、1.0 mg·L-1，NAA的濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1，配置成6種不同的誘導培養基；以MS0（不添加6-BA和NAA）為對照。每處理10瓶，滅菌后每瓶接種5 mm×5 mm的內層、中層、外層鱗片各1塊，先進行1 d 的黑暗培養，然后進行光照培養，光照周期為L∶D=16 h∶8 h，光照強度為2 000～3 000 lx，培養溫度為（25±2）℃。觀察統計內層、中層、外層鱗片誘導不定芽的情況。鱗片接種后45 d，統計再生芽數和不定芽再生頻率。

1.2.2 細胞分裂素與生長素對不定芽增殖的影響以MS為基礎培養基，加入30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，另分別添加0.5、0.8 mg·L-1的6-BA，再分別加入0.05、0.10、0.50 mg·L-1的NAA，配置成6種不同的增殖培養基。不定芽形成并長出1～2片葉時，轉接到上述培養基上進行不定芽繼代培養，以生產上常用的增殖培養基MS+0.10 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA為對照。每處理10瓶，滅菌后每瓶轉接5個不定芽，觀察小苗的長勢。30 d后統計新增芽數。

1.2.3 不同濃度活性炭（AC）對鱗莖生長及生根的影響 將增殖生長30 d后的小苗剪去葉片，不定芽單個分開，接種到不同濃度AC的壯苗生根培養基MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖上，AC濃度分別為0、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 g·L-1。每處理5瓶，5次重復，35 d統計鱗莖生長及生根情況（王和飛和林應耀，2005）。

2 結果與分析

2.1 外植體再生不定芽的形態學觀察

蘭州百合外植體接種在培養基上，7 d左右邊緣翹起，變綠；14 d后切口處有褐化現象，近軸面基部傷口處分化出分生組織，形成愈傷組織，鱗片內層形成肉眼可見的1～2 mm小突起，隨著培養時間延長，小突起逐漸變大、顏色逐漸加深；21 d 后小突起逐漸發育成膨大的不定芽（圖1-a）。繼續培養14 d，不定芽膨大并開始展葉（圖1-b）。

無論是何種激素配比處理，中層、內層鱗片再生頻率均高于外層鱗片，更適于作為外植體。

圖1 蘭州百合外植體

2.2 細胞分裂素與生長素對蘭州百合鱗片再生的影響

蘭州百合鱗片在6-BA和NAA不同濃度配比的6種培養基上均能誘導出不定芽，但誘導效應不同（表1）。6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1的培養基誘導率最高，為90.0%，且小苗的長勢最好；6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，隨NAA濃度的增加，誘導率雖較高，但分化出的叢芽太過密集，單芽質量差，有的還出現畸形、玻璃化等現象，說明NAA濃度過高或過低均不利于不定芽的誘導，且小苗長勢一般。

表1 不同激素濃度配比對蘭州百合鱗片再生的影響

2.3 細胞分裂素與生長素對蘭州百合不定芽增殖的影響

將經誘導分化的不定芽接種在含6-BA和NAA不同濃度配比的6種增殖培養基上，15 d后長出新芽。由表2可知，T4處理不定芽增殖率最高，且小苗長勢最好。6-BA濃度不變時，隨著NAA濃度增加，平均每芽新增芽數也減少；NAA濃度不變時，隨著6-BA濃度增加，新增鱗芽數增加，表明較高濃度的細胞分裂素及較低濃度的生長素有利于蘭州百合不定芽增殖。

2.4 不同濃度AC對蘭州百合鱗莖膨大生根的影響

將增殖的健壯不定芽接種在不同AC濃度的培養基上，35 d后均生根（表3），且鱗莖平均鮮質量、平均直徑均隨AC濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，生長勢表現為先強后弱，而平均生根數逐漸下降，但均明顯高于不含AC的處理，說明加入適當濃度的活性炭有利于鱗莖的膨大和生根。

表2 不同激素濃度配比對蘭州百合不定芽增殖的影響

表3 不同濃度AC對蘭州百合鱗莖膨大生根的影響

3 結論與討論

本試驗分別以蘭州百合的內層、中層、外層鱗片為外植體進行誘導培養，發現中層鱗片再生的鱗莖最多且較大，內層鱗片次之，外層鱗片最差，且外層鱗片機械損傷嚴重，病菌多，易于污染。

本試驗結果表明，外植體在6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1的培養基上誘導培養45 d后不定芽再生率最高，為90%，且不定芽形成的小苗長勢最好，這與李倩中等（2003）得出的6-BA、NAA濃度組合相一致；最適不定芽增殖培養基為MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，培養30 d后每個不定芽可增殖4.5個，小苗長勢壯，這與王剛等（2002）報道的結果相一致；將增殖的不定芽接入MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC壯苗生根培養基中，35 d后鱗莖略膨大、長有2～3片葉、生出4～5條根時移栽，營養土配方為珍珠巖∶草炭土=2 V∶8 V，成活率可達98%以上。

本試驗是在基本恒定的環境條件下開展的，環境因子與影響鱗片分化、鱗芽增殖、鱗莖膨大的激素濃度和配比的相關性，培養系統中最佳的環境與激素組合等問題還需要深入研究。

韓華麗，郭成金．2009．蘭州百合的組織培養．天津師范大學學報：自然科學版，29（3）：62-65．

劉靜. 2011. 蘭州百合快速繁殖研究. 南方農業學報，42（8）：839-842．

李倩中，劉曉青，陳尚平．2003．不同濃度IBA和6-BA對百合組織培養的影響．南京農專學報，19（2）：43-45．

王剛，杜捷，李桂英，梁萬福，幸亨泰． 2002．蘭州百合和野百合組織培養及快速繁殖研究．西北師范大學學報：自然科學版，38（1）：69-71．

王和飛，林應耀．2005．百合組織培養生根的初探．瓊州大學學報，12（2）：24-26．

Establishment of Highly Efficient Regeneration System of Lanzhou Lily

CUI Xing-lin1，QIN Xin-hui1*，LIU Fen2，YI Wan-wei1

（1Biological Engineering Department，Jiuquan Vocational and Technical College，Jiuquan 735000，Gansu，China；2Institute of Woods and Flowers，Gansu Province Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 733000，Gansu，China）

Taking fresh Lanzhou lily〔Lilium. davidii Duch. var. unicolor（Hoog）Cotton〕scale as explant，this paper explored the establishment of highly efficient regeneration system．The results showed that the middle and inner layer of the scales were superior than the outer ones，and more suitable to be explant．The scales regeneration frequency reached the highest in medium of MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，up to 90.0%．A small bud had the highest proliferation rate in the medium of MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，with an average number of 4.5 per bud new shoots．The medium of MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC facilitated the enlargement growth of test-tube plantlets，and their survival rate was over 98% after transplanting．

Lanzhou lily；NAA；6-BA；Regeneration system

崔興林，男，講師，主要從事園藝教學及科研工作，E-mail：jqzycxl@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：秦新惠，女，副教授，主要從事植物組織培養、無土栽培的教學與研究工作，E-mail：qinxinhui@126.com

2013-12-12；接受日期：2014-01-07

2012酒泉市市列科技計劃項目