藏藥小檗花的質量標準研究

李艷，杜蕾蕾，張小靈，劉川，賴先榮，張藝，范剛

小檗花，藏藥名為“杰唯美多”、“吉嘎爾梅朵”等，收載于《四部醫典》、《晶珠本草》、《中國藏藥?第三卷》、《中華藏本草》等藏醫藥著作[1～4]。藏藥小檗花味甘、性涼，具有解毒、止瀉、利濕、干黃水、止血、消炎等功效，常用于治療熱瀉、瘟疫、陳舊熱、出血癥等[1～4]。目前，小檗花藥材的化學成分及質量評價研究報道甚少，僅1991 年Sivakumar等[5]從小檗科小檗屬植物Berberis aristata花中分離得到綠原酸、咖啡酸、槲皮素、蘆丁和臘梅苷等成分，但國內外未見這些成分的含量測定和藥材質量標準研究報道。為了提高小檗花藥材的質量控制水平，本文根據《中國藥典》質量標準研究制定技術要求，對小檗花藥材進行了顯微鑒別、薄層鑒別研究，測定了水分、總灰分、酸不溶性灰分含量，同時采用HPLC法測定了有效成分綠原酸的含量，為其開發利用和質量控制提供了科學依據。

1 儀器與試藥

美國Agilent 1200高效液相色譜儀，配備二極管陣列（DAD）檢測器、自動進樣器和柱溫箱；DHG-9023A型電熱鼓風干燥箱 (上海一恒科技有限公司)；Sartorius BP121s電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；2.5-12型箱式電阻爐（沈陽市節能電爐廠）；ULUP-I-10T優普超純水機（成都超純科技有限公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海必能信有限公司）。

綠原酸對照品（批號：110781-200512，供含量測定用）購自中國藥品生物制品檢定所，使用前置干燥器中干燥至恒重。乙腈為色譜純（Fisher），水為超純水，其余試劑均為分析純。本文共收集了5批小檗花藥材，經成都中醫藥大學賈敏如教授鑒定其為小檗科植物金花小檗Berberis wilsonaeHemsl.和刺黃花Berberis polyanthaHemsl.的干燥花及花蕾，藥材來源見表2。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

取5批小檗花藥材樣品，分別粉碎，照顯微鑒別法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅡC），觀察其粉末的顯微特征。本品粉末黃棕色至棕色。花粉粒淡黃色，呈圓球形、類圓形，直徑40～50 μm，表面有點狀雕紋。萼片表皮細胞表面觀類多角形或稍不規則，壁薄，較平直。花冠表皮細胞類長圓形或類多角形，垂周壁薄，較平直，含多數淡黃色物，花冠裂片頂端表皮細胞外壁突起呈短絨毛狀。柱頭及花柱上部表皮細胞分化成圓錐形單細胞毛，先端尖或稍鈍。花粉囊內壁細胞表面觀呈長圓形，具網狀或不規則螺旋狀增厚。導管為梯紋、螺紋，直徑15～40 μm。見圖1。

圖1 小檗花藥材粉末顯微特征圖

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.2.3 薄層色譜條件及結果 照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液2 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶1.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，在105 ℃加熱數分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖2。

圖2 小檗花的TLC圖

2.3 檢查

水分測定按照《中國藥典》2010年版一部附錄IX H第一法測定，總灰分、酸不溶性灰分按照《中國藥典》2010年版一部附錄IX K方法測定，結果見表2。

2.4 綠原酸的HPLC含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 × 4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），檢測波長：327 nm，流速：1.0 mL．min-1，柱溫：30℃，進樣量：10 μL，理論塔板數按綠原酸峰計算應不低于5000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含90 μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.4 線性關系的考察 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.40 mg的對照品貯備溶液。分別精密吸取對照品貯備溶液1.35，1.80，2.25，3.75，7.50，15.00 mL至不同的10 mL量瓶中，加甲醇制成不同濃度的綠原酸對照品溶液。精密吸取綠原酸對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以綠原酸峰面積值為縱坐標，濃度（mg．mL-1）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：Y = 32912 X - 110.83（r = 0.9999），綠原酸在0.054～0.600 mg．mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取綠原酸對照品溶液（0.09 mg．mL-1）10 μL，連續進樣5次，記錄峰面積，結果綠原酸峰面積的RSD為0.18%，表明精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 分別精密吸取綠原酸對照品溶液（0.09 mg．mL-1）各10 μL，于0，1，2，4，12，24 h分別注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，其RSD為0.13%，表明對照品溶液在24小時內穩定。

2.4.7 重復性試驗 取同一批樣品（批號：2013071702）粉末約0.2 g，共6份，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液。在上述色譜條件下，依法測定，計算綠原酸的含量。結果，本批藥材中綠原酸的平均含量為0.45%，RSD為1.61%，表明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取同一批（批號：2013071702）已知含量的小檗花樣品粉末9份，每份約0.1 g，精密稱定，分別按已知含量的80%，100%，120%三個水平加入綠原酸對照品，再按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定綠原酸的含量，計算回收率，見表1。結果綠原酸的加樣回收率在95～105%之間，平均回收率為98.75%，RSD為1.22%。

表1 綠原酸加樣回收率試驗結果

2.4.9 樣品含量測定 取不同批次的小檗花藥材樣品，平行2份，按供試品溶液制備項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定綠原酸的含量。對照品及供試品的HPLC圖譜見圖3，含量測定結果見表2。

圖3 對照品（A）和供試品（B）的HPLC圖譜（1.綠原酸）

表2 小檗花藥材檢查項及綠原酸含量測定結果（n = 2）

從表2可知，5批藥材中綠原酸的含量在0.44%～2.64%之間，不同品種的小檗花藥材綠原酸含量差異較大，金花小檗的綠原酸含量平均值為0.60%，刺黃花的綠原酸含量平均值為2.52%，不同的植物物種由于遺傳背景差異而影響了化學成分的合成與積累。課題組前期調查發現，藏醫臨床所使用的小檗花藥材的“基源”十分混亂，小檗屬多個品種均可入藥。根據本文的研究結果，今后應密切注意不同品種小檗花藥材的療效差異。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

小檗花主要含有酚酸（綠原酸、咖啡酸）及黃酮類（槲皮素、蘆丁、臘梅苷）成分[5]，本實驗采用HPLC-DAD法，通過對照品對照，并比對紫外吸收圖譜，發現小檗花藥材中含有較高含量的綠原酸，而咖啡酸、蘆丁、槲皮素等成分含量甚微。現代研究表明，綠原酸具有明顯的抗菌、抗病毒作用，并能縮短凝血及出血時間[6～8]，這與藏醫用小檗花治療瀉痢、失血等癥相吻合。因此，本文選擇綠原酸作為小檗花藥材的薄層鑒別及含量測定的指標性成分是合理的。

3.2 薄層鑒別條件的考察

本文考察了乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶1.5）、乙酸乙酯-甲酸-乙醇（7∶2∶1）、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）等溶劑系統，結果乙酸丁酯-甲酸-水溶劑系統展開效果最佳。考察了供試品溶液不同的點樣量（1, 2, 3, 5 μL），結果發現點樣量為2 μL時，綠原酸斑點圓整、清晰。另外，本文還考察了不同薄層板、溫度、濕度等條件對薄層展開的影響程度，結果不同的薄層板、溫度和濕度對展開結果沒有影響，綠原酸均能得到很好的分離，說明建立的薄層鑒別方法的耐用性較好。

3.3 綠原酸HPLC含量測定條件的考察

目前，小檗花中綠原酸的HPLC含量測定未見報道，本文參考《中國藥典》2010版一部“金銀花”、“杜仲葉”藥材中綠原酸HPLC含量測定方法，通過大量實驗，確定了最佳的HPLC色譜條件。在供試品溶液制備時，考察了甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇溶劑的提取效率，結果70%甲醇的提取效果最佳；考察了超聲、冷浸、水浴回流3種不同提取方法，結果超聲提取比回流、冷浸提取的效率更高。此外，本文還對超聲時間、提取次數、溶劑用量等參數進行了單因素考察，最終確定了最優的供試品溶液制備方法。

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