穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1誘發(fā)小鼠感染模型的體內(nèi)保護作用研究

何巧，陳思敏，王志華，何敏，諶立巍

穿心蓮內(nèi)酯為中藥穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees重要的藥效成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、治療心腦血管疾病等多種作用[1～2]。其中有研究顯示穿心蓮內(nèi)酯抗菌作用范圍廣泛，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等具有較強的抑菌作用，在臨床上具有良好的療效，并可有效降低銅綠假單胞菌毒力因子如綠膿菌素、胞外蛋白水解酶、彈性蛋白酶活性從而實現(xiàn)抗感染作用[3～4]。本課題組在前期的中藥抗菌有效成分研究的過程中，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可通過影響銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS），降低該菌的耐藥性發(fā)揮抗菌作用[5]。因此，本實驗擬采用小鼠腹腔感染銅綠假單胞菌PAO1，考察穿心蓮內(nèi)酯配比左氧氟沙星的體內(nèi)抗感染作用，為將該藥物開發(fā)成抗菌藥物增效劑提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種

銅綠假單胞菌PAO1野生株（Pseudomonasaeruginosa O1，PAO1）由中國科學(xué)院上海藥物研究所贈送。原始菌種保存于-20℃冰箱（甘油保存）；試驗前菌種于M-H(A)平板復(fù)活后，選取長勢良好的單一菌團涂抹于M-H(A)斜面，35℃隔夜孵育后密封，4℃冷藏保存?zhèn)溆茫辉囼炃耙惶烊⌒泵婢磕ㄓ贛-H(A)平板，35℃孵育過夜，即可使用。

1.2 試藥

穿心蓮內(nèi)酯（四川禾嘉華福寧制藥有限公司，生產(chǎn)批號：cxltqw20110528），經(jīng)高效液相色譜（HPLC）鑒定，純度高于99%；左氧氟沙星（上虞京新藥業(yè)，生產(chǎn)批號：DK20-1202093），經(jīng)經(jīng)銷廠家HPLC測定后，純度達97.4%，符合實驗要求；M-H(A)和M-H(B)培養(yǎng)基（OXOID公司，CM0337A和CM0405B）；其他耗材均由成都雅榮生化設(shè)備經(jīng)營部購買提供。

1.3 儀器

全波長多功能讀數(shù)儀（Thermo 公司）；MILLIPORE Synergy超純水儀（Milipore公司）；超凈工作臺（上海躍進醫(yī)療器械廠）；精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；低溫冷凍離心機Sorvall ST 16R（Thermo Fisher）。

1.4 動物

SPF級KM種小白鼠，18-22 g，雌雄各半，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供（生產(chǎn)合格證號：川實動質(zhì)管第005號；實驗動物使用合格證號：川實動質(zhì)管第022號）。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯的協(xié)同抗感染作用

2.1.1 復(fù)制小鼠PAO1腹腔感染模型 將保存于斜面的銅綠假單胞菌PAO1 35℃隔夜孵育復(fù)活，挑3～4個單菌落溶于4 mL M-H(B)培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)菌濃度為0.5麥氏（1.5×108CFU．mL-1）濃度，并稀釋定容至40 mL；用無菌吸管反復(fù)吹打使細菌均勻混懸后將菌液隔夜增菌培養(yǎng)16 h（35℃，空氣搖床振搖16 h），次日取出原菌液測OD值（細菌生長飽和期）。取20 mL,分裝于離心管中，每管2 mL，離心（10000～15000 rpm．min-1，10 min），棄上清液，用2 mL生理鹽水混勻后，再離心（15000 rpm．min-1，10 min），棄上清液；再在離心管中加入生理鹽水2 mL，用吸管充分混勻后收集細菌細胞菌體2 mL，設(shè)定該菌液為100菌液濃度，用0.5%的滅菌胃膜素（mucin）進行稀釋，稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4備用。取體重18～22 g的小鼠，隨機分組，每組8只，分別ip 注射上述菌液至小鼠體內(nèi)，0.5 mL/只。觀察記錄各組小鼠24 h死亡情況，以致小鼠90%～100%死亡的最低感染菌量做為最小致死菌量（MLD）。結(jié)果顯示10-2為最佳劑量，以該菌量做為體內(nèi)感染的菌量復(fù)制小鼠感染模型。

2.1.2 摸出給藥的合適劑量范圍 得出銅綠假單胞菌MLD后，以左氧氟沙星的臨床指定劑量計算小鼠給藥劑量，并以該劑量為最高劑量，再10倍稀釋左氧氟沙星共獲得6個劑量，再分別灌胃給予小鼠不同劑量的左氧氟沙星，摸出致感染細菌的小鼠出現(xiàn)0%～100%存活（或者死亡）的給藥劑量范圍。選擇小鼠存活率為40%～50%時左氧氟沙星劑量。結(jié)果顯示左氧氟沙星的最佳劑量為0.2 mg．kg-1。

2.1.3 穿心蓮內(nèi)酯和左氧氟沙星配比劑量范圍 以2.1.2實驗結(jié)果為依據(jù)，將左氧氟沙星的劑量固定為0.2 mg．kg-1，選擇4個較佳配合穿心蓮內(nèi)酯的組合為受試藥物.具體見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯配比左氧氟沙星劑量

2.1.4 體內(nèi)保護性實驗 取健康KM小鼠，體重18～22 g，隨機分組，每組50只鼠，雌雄各半，分別腹腔感染1 MLD菌量的受試菌液，0.5 mL/只，感染后即刻灌胃給予不同受試藥物，僅給一次，給藥后觀察并記錄各給藥組小鼠的死亡數(shù)（或存活數(shù)），連續(xù)觀察3天（72 h）。同時設(shè)感染對照組及空白對照組。

2.1.5 統(tǒng)計處理 根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)（或存活數(shù)）用SPSS統(tǒng)計軟件17.0，采用X2方法統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2.1.6 實驗結(jié)果 具體見表2。實驗的結(jié)果總體顯示左氧氟沙星配比一定劑量穿心蓮內(nèi)酯，有提高左氧氟沙星體內(nèi)抗感染保護作用的趨勢，且在配合穿心蓮內(nèi)酯0.28×10-3時，藥物的體內(nèi)保護作用要優(yōu)于單獨使用左氧氟沙星（p＜0.05），提示穿心蓮內(nèi)酯可增強銅綠假單胞菌對左氧氟沙星的敏感性。

表2 穿行連內(nèi)酯配比左氧氟沙星對PAO1腹腔感染模型的體內(nèi)保護作用

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1 24 h生長速率的影響

2.2.1 樣品配制 稱取穿心蓮內(nèi)酯300 mg，加入3 mL二甲基亞砜（DMSO）配成100 mg．mL-1的穿心蓮內(nèi)酯DMSO溶液。吸取1 mL 100 mg．mL-1的藥液加入9 mL DMSO得10 mg．mL-1的藥液，依次配制1、0.1、0.01、0.001 mg．mL-1的藥液。將4℃冷藏保存的PAO1轉(zhuǎn)染至M-H(A)平板上隔夜培養(yǎng)。將長勢良好的1～2個傳代菌落用生理鹽水調(diào)至菌液濃度為0.5麥氏濃度。精密量取10 μL藥液與9.98 mL M-H（B）培養(yǎng)基均勻混合，裝于消毒試管中，再精密吸取10 μL菌液，渦旋儀充分混勻受試樣本。分別吸取200 μL加入96孔板中，每組8個復(fù)孔，同時設(shè)僅加入相同劑量DMSO空白對照組（組7）和僅加入培養(yǎng)基的空白對照組（組8）。具體見表3。

表3 試管基質(zhì)中菌量和各組藥物含量

2.2.2樣品檢測 將加有樣本的96孔板在35℃培養(yǎng)箱中孵育，每隔1h，取樣品在420 nm全波長多功能酶標儀下測OD值。將空白組各孔OD值取平均值，設(shè)為OD0。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 記錄各組數(shù)據(jù)，每組取平均值，各組OD值減去OD0作為該組OD值。并作圖表示。

2.2.4 實驗結(jié)果 結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯各組生長曲線與DMSO空白組之間無差異具體見圖1。提示穿心蓮內(nèi)酯不影響PAO1的生長，且DMSO對PAO1無影響。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌24h內(nèi)生長的影響

3 討論

抗生素長期應(yīng)用導(dǎo)致臨床有效率不斷降低，而且藥物的大量使用還可誘導(dǎo)細菌的高度耐藥和多重耐藥的產(chǎn)生，所以臨床相關(guān)感染的治療變得非常棘手。長期的臨床實踐證實中藥在細菌感染性疾病治療方面具有明確的療效，穿心蓮是清熱解毒中藥中的代表之一，長期用于細菌感染的治療，療效確切。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是臨床上獲得性感染的重要條件致病菌，常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等多種疾病[6]。近年來，由于大量強效抗菌藥物的廣泛使用，使該菌種呈現(xiàn)出天然或獲得性多重耐藥,造成難以治愈的嚴重感染[7]。本實驗通過建立銅綠假單胞菌PAO1小鼠腹腔感染模型，以動物死亡率為指標考察藥物的體內(nèi)保護作用。結(jié)果顯示在一定的配比劑量下，加入了穿心蓮內(nèi)酯的左氧氟沙星普遍表現(xiàn)出保護性作用增強；但是通過測定24 h細菌生長曲線，顯示穿心蓮內(nèi)酯沒有直接影響細菌生長的作用。綜合實驗結(jié)果和目前穿心蓮內(nèi)酯的抗菌作用研究進展，提示穿心蓮內(nèi)酯在體內(nèi)可能還通過其它途徑發(fā)揮抗菌協(xié)同作用。

[1] 楊靜.穿心蓮內(nèi)酯的研究進展[J].中草藥,2009,40(7):1168.

[2] 史傳英,董六一.亞硫酸氫鈉穿心蓮內(nèi)酯的抗炎解熱鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,18(12):5.

[3] 李洪濤,吳春民,覃慧敏,等.穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1株MexAB-OprM外排泵mRNA表達的影響[J].中華傳染病雜志,2007,25(6):338.

[4] 李洪濤,覃慧敏,王衛(wèi)華,等.穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌QS毒力因子的影響[J].中國中藥雜志,2006,31(12):1015.

[5] 陳思敏,諶立巍,何敏,等.穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的及對lasR/rhlR表達的調(diào)控機制[J].中藥與臨床2014,30(2):24.

[6] Lisa S,Jane S.Infection control in cystic fibrosia[J].Clin Microbiol Rev.2004,17(1):57.

[7] Nathan EH,Hongwei Y.Cross-sectional analysis of clinical and environmental isolates of Pseudomonas areuginosa:biofilm formation,virulence,and genome diversity[J].Infect Immun,2004,72(1):133.