野生赤芍和栽培芍藥的芍藥苷、苯甲酸含量測定

胡媛，趙梓辰，楊昌林，劉友平

赤芍為歷版《中國藥典》收載品種，來源于毛茛科植物芍藥Paeonia lactifioraPall. 或川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根。味苦，微寒，歸肝經，清熱涼血，散瘀止痛，用于熱入營血，溫毒發斑，吐血衄血，目赤腫痛，肝郁脅痛，經閉痛經，癓瘕腹痛，跌撲損傷，癰腫瘡瘍，為臨床常用中藥材。芍藥有野生品和栽培品，傳統認為赤芍以野生的芍藥根曬干入藥為好；而栽培芍藥一般去皮后煮熟，暴曬至干，作白芍藥用。但由于近年野生芍藥資源的急劇下降，市場上出現栽培芍藥的細小根直接干燥作為赤芍藥用的現象，其科學性和合理性還有待深入研究。

現代研究表明，單萜苷中的芍藥苷是芍藥的主要有效成分[1～3]，具有抗自由基損傷、抑制細胞內鈣超載和抗神經毒性等活性、抗炎、鎮痛等作用，而芍藥中的苯甲酸[4～5]，會增加肝臟的解毒負擔，攝入一定量會產生不良反應，其對機體有致突變作用，可能導致非免疫型接觸性蕁麻疹及非免疫直接接觸反應，如風疹、紅斑、瘙癢癥等，被認為是芍藥中的有害成分，實驗研究還發現，由于芍藥中的單萜苷類成分含有苯甲酰基，在一定條件下可水解為大量的苯甲酸。為了客觀檢測赤芍商品藥材中芍藥苷與苯甲酸的真實含量，本實驗采用RP-HPLC法同時測定34批芍藥藥材（22批來源于栽培芍藥，12批來源于野生芍藥）中芍藥苷與苯甲酸的含量，為栽培芍藥當赤芍藥用的合理性提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀島津LC10-ATVP，CLASS-VP工作站；色譜柱為Hypersil ODS（200mm×4mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司)；電子分析天平BP211D（十萬分之一），BP121S（萬分之一）（德國Sartouris股份有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；BUG25-12超聲波清洗機（上海必能信公司）。

1.2 材料與試劑

芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-200732）；苯甲酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100419-200301）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；其余試劑為分析純。

1.3 藥材

赤芍藥材樣品編號及來源見表1。

表1 赤芍藥材樣品收集和鑒定表

SYZ-19 P.lactifiora Pall. 四川中江縣籍慶鎮 根莖(自采)SYZ-20 P.lactifiora Pall. 四川中江縣石泉鄉 根莖(自采)SYZ-21 P.lactifiora Pall. 四川中江縣石泉鄉 根莖(自采)SYZ-22 P.lactifiora Pall. 成都中醫藥大學峨眉校區GAP基地 根莖(自采)

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液的制備 取芍藥苷和苯甲酸對照品各5 mg、2.5 mg，精密稱定，分別置10 mL、25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得含芍藥苷0.504 mg．mL-1和含苯甲酸0.105 mg．mL-1的溶液作為對照品儲備液。從中分別精密量取芍藥苷與苯甲酸對照品儲備液各5 mL、2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得含芍藥苷252 μg．mL-1和含苯甲酸21 μg．mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取赤芍細粉（過三號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水-甲酸（95∶5）10 mL，稱重，浸泡2 h，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，用水-甲酸（95∶5）補足減失的重量，過濾，收集續濾液，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱Hypersil-ODS C18(4.6×200 mm,5 μm)，流動相甲醇-0.1%磷∶酸水（27∶73），流速1.0 mL．min-1，柱溫30 ℃，檢測波長230 nm。在上述條件下，芍藥苷與苯甲酸完全分離，色譜圖見圖1、圖2。以芍藥苷峰計算理論塔板數為8000。

圖1 芍藥苷與苯甲酸混合對照品HPLC色譜圖

圖2 芍藥樣品測定芍藥苷與苯甲酸含量HPLC色譜圖

2.3 線性關系考察

取混合對照品溶液，采用逐級稀釋法，得含芍藥苷15.75 μg．mL-1、31.5 μg．mL-1、63 μg．mL-1、126 μg．mL-1、252 μg．mL-1和含苯甲酸1.3125 μg．mL-1、2.625 μg．mL-1、5.25 μg．mL-1、10.5 μg．mL-1、21 μg．mL-1對照品溶液，按照上述色譜條件分別進樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱座標，芍藥苷（或苯甲酸）（μg）為橫座標，進行回歸，得芍藥苷回歸方程y=1×106x-23310，R2=0.9997，芍藥苷在0.315～5.040 μg．mL-1內與峰面積呈良好的線性關系；得苯甲酸回歸方程y=5×106x+8881.4，R2=0.9998，苯甲酸在0.02625～0.42000 μg．mL-1內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液20 μL，重復進樣6次，分別測定峰面積，結果表明芍藥苷的RSD為1.21%，苯甲酸的RSD為1.56%，用本方法進樣精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取芍藥供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h測定峰面積，結果表明芍藥苷的RSD為2.01%，苯甲酸的RSD為2.27%，供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

取芍藥6份，制備供試品溶液，照上述色譜條件進行實驗，記錄色譜圖，并計算含量，結果表明芍藥苷平均質量分數為59.80 mg ．g-1，RSD為2.52%；苯甲酸的平均質量分數為0.504 mg．g-1，RSD為2.74%，該方法重現性良好。

2.7 加樣回收試驗

取芍藥6份，每份0.05 g，精密稱定，兩份一組，各組分別加入芍藥苷對照品溶液（1.274 mg．mL-1）2.0 mL、2.4 mL、2.8 mL，苯甲酸對照品溶液（0.0250 mg ．mL-1）0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，揮去溶劑，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備中從“置具塞錐形瓶中…”開始制備供試品溶液，依法測定，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表2、表3。

表2 芍藥苷加樣回收試驗結果

表3 苯甲酸加樣回收試驗結果

3 0.0501 0.025 0.025 0.051 103.06 102.15 2.73 4 0.0503 0.025 0.025 0.051 103.07 5 0.0502 0.025 0.030 0.056 103.09 6 0.0504 0.025 0.030 0.054 96.54

結果表明：芍藥苷平均回收率為97.02%，RSD為1.34%，苯甲酸平均回收率為102.15%，RSD為2.73%，該方法準確度良好。

2.8 樣品含量測定

分別取供試品溶液及混合對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算含量，結果見表4。

表4 34批赤芍商品藥材中芍藥苷與苯甲酸含量測定結果(n=2)

由上表可知，上述34批芍藥商品藥材中有33批藥材符合《中國藥典》2010版的規定（芍藥苷含量＞18.0 mg．g-1）。栽培芍藥和野生芍藥的芍藥苷含量采用SPSS 19.0統計軟件中非參數檢驗（兩樣本秩和檢驗，Mann-Whitney U），得到P=0.007＜0.05，說明二者存在顯著性差異；對栽培芍藥和野生芍藥的苯甲酸含量采用SPSS 19.0統計軟件中非參數檢驗（兩樣本秩和檢驗，Mann-Whitney U），得到P=0.000＜0.05，說明二者存在顯著性差異。

3 討論

本試驗采用HPLC法同時測定芍藥藥材中芍藥苷與苯甲酸含量，該法重復性好，可靠性強，對栽培的芍藥當赤芍藥用的合理性研究具有重要意義。對實驗結果進行分析發現，試驗采用的22批栽培芍藥中有21批藥材符合《中國藥典》2010版的規定（芍藥苷含量＞18.0 mg．g-1），說明栽培芍藥當做赤芍藥用具有一定的可行性和合理性，但是栽培芍藥和野生芍藥的芍藥苷和苯甲酸含量都存在顯著性差異，說明栽培芍藥和野生赤芍在一定程度上不具有質量等同性，栽培芍藥代替野生芍藥當做赤芍藥用還需要結合其他化學成分和藥理作用的比較進行深入研究。

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[3] 劉浩.反相高效液相色譜法測定白芍提取物中芍藥苷的含量[J].時珍國醫國藥,2010,21(9):2392.

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