參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響

賈丹兵，于 淼，李乃民，唐立明，李春杰，朱 宇，劉 珊

參姜鎖陽益氣片由西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜、麥冬、補骨脂等組成，具有聚宗氣、暖身體、溫五臟、耐寒冷等作用。藥理實驗研究證明，參姜鎖陽益氣片可以調(diào)控寒凝氣滯血瘀證大鼠血液中6-酮前列腺素 F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素 2(TXB2)水平并能改善模型大鼠氧自由基代謝［1］。臨床實踐表明參姜鎖陽益氣片能提高高寒地區(qū)運動性疲勞人群的耐寒及抗缺氧能力［2］。中醫(yī)理論認為，寒邪所造成的血液滯澀、經(jīng)脈血瘀、五臟受損，不能單純衛(wèi)外，應(yīng)治五臟皆有之中寒［3］。本研究采用不同劑量參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠進行實驗研究，從下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸及中樞神經(jīng)遞質(zhì)等方面探討該藥物的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠36只，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［許可證號SCXK(黑)2008004］，體重(200 ±20)g，常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 實驗儀器及藥品

1.2.1 主要儀器:Ht2型酶標(biāo)儀、洗板機(奧地利博塞)，TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BRAND系列單道可調(diào)移液器(德國)。

1.2.2 主要藥品及試劑:參姜鎖陽益氣片由西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜、麥冬、補骨脂等組成，將處方中藥材按一定比例配好后密封罐蒸煮加壓，用水提取法濃縮、噴霧、干燥，獲取精純浸膏粉藥，制成片劑，每片0.40 g(含有效成分0.35 g，批號:20100702);大株紅景天膠囊由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號:081108);鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號:1007121);水合氯醛(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腎上腺皮質(zhì)酮(CORT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備:隨機選取6只大鼠為A組，其余30只大鼠采用腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法建立寒凝氣滯血瘀證大鼠模型［4］。方法如下:大鼠皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08 ml/100 g，注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置4℃冰水浸泡5 min，于第2天將大鼠分別放入低溫冷柜鼠籠中，在-20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h，每日1次，連續(xù)7日。將造模成功的30只大鼠隨機分為 B、C、D、E、F組，每組各6只，分別編號、標(biāo)記、稱重。

1.3.2 給藥方法:各組在末次造模后1 h，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥2周，給藥劑量按成人每日每公斤體重用量進行折算如下:C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg;A、B組分別給予等體積生理鹽水。

1.3.3 血中ACTH、CORT水平檢測:在相應(yīng)時間點，各組大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血3 ml，3000 r/min離心10 min，分離血清，-70℃保存用于檢測，成批測定，以免產(chǎn)生批間差。檢測方法嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量檢測:取血完成后，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至升主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，大鼠斷頭后快速于冰盤上取出全腦，分離出海馬和下丘腦，迅速放入液氮中備用。腦組織樣品放入研磨器中，加入液氮并研成精細的粉末，待液氮揮發(fā)后稱重，以10倍體積的生理鹽水溶解，在冰浴下制備成組織勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f明書進行操作。

1.3.5 ELISA檢測:操作步驟按試劑盒說明書進行:①使用前將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量泡沫，以免加樣時產(chǎn)生誤差。②將樣本用樣本稀釋液1∶1稀釋后加入50μl于各反應(yīng)孔中，每個樣本做一個平行樣。③加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl于反應(yīng)孔，加入待測樣品50μl于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50μl生物素標(biāo)記抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃孵育1 h。④甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)3次。⑤每孔加入60μl親和鏈霉素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30 min。⑥甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)操作3次。⑦每孔加入底物A、B各50μl，輕輕振蕩混勻，37℃孵育10 min，避免光照。⑧取出酶標(biāo)板，迅速加入50μl終止液，并立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔吸光度(OD)值。

1.3.6 結(jié)果計算:以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以待測指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的曲線，根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血中ACTH、CORT水平 與A組比較，B組ACTH、CORT水平均升高(P＜0.01);與B組比較，C、D、E、F組血清中 ACTH、CORT水平均有不同程度的降低(P＜0.05，P＜0.01)，以D、E組變化最顯著(P＜0.01);與F組比較，E組血中 ACTH、CORT水平降低，C組血中 CORT水平顯著升高(P＜0.01)，D組血中 ACTH、CORT水平和 C組血中ACTH水平與F組比較無差異(P＞0.05)，見表1。

表1 6組大鼠血中垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺皮質(zhì)酮水平(x ± s，pg/ml)

2.2 腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量 與A組比較，B組腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量升高(P ＜0.01);與 B 組比較，除 C、D 組 DA 外，C、D、E、F組腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量均降低(P＜0.05，P＜0.01)，以E 組變化最顯著(P ＜0.01);與 F組比較，C組腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量均升高，E組腦組織勻漿中DA含量降低(P＜0.05);D組腦組織勻漿中DA、5-HT、NE含量和E組5-HT、NE含量與F組比較無差異(P＞0.05)，見表2。

3 討論

下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸是動物參與應(yīng)激反應(yīng)最重要的調(diào)控體系。寒冷環(huán)境下，ACTH分泌增多，使腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加［5］，加速細胞能量代謝、肝糖原分解、糖原異生，這些反應(yīng)對提高組織代謝、增加產(chǎn)熱、維持體溫都具有重要的作用［6］。中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)參與體溫調(diào)節(jié)活動，并且是溫度敏感神經(jīng)元活動的神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)。體溫調(diào)節(jié)的單胺學(xué)說認為5-HT和NE這兩種物質(zhì)在量上的動態(tài)平衡可以保持體溫的恒定［7］。王洪琦等［8］研究表明，體溫偏高的大鼠，其視前區(qū)-下丘腦前部腦組織中的DA含量明顯高于正常大鼠，提示DA參與體溫的調(diào)節(jié)。

表2 6組大鼠腦組織勻漿中多巴胺、5-羥色胺和去甲腎上腺素含量變化(x ± s，pg/ml)

參姜鎖陽益氣片方中以西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜為君藥，溫中祛寒行血，重在針對高寒缺氧所致的寒厥氣衰;以麥冬、補骨脂、淫羊藿等為臣藥，益肺補腎，以御寒邪直傷五臟六腑之功;以鎖陽、紅花等為佐藥，祛除寒邪所致臟腑缺血少氣之諸癥;以鹿茸、蓽拔為使藥，陽中益陰又調(diào)和諸藥。大株紅景天具有益氣活血通脈的功效［9］，作為臨床肯定程度較高的一類活血化瘀藥物［10］，其對患者血液循環(huán)狀態(tài)的影響作用日益受到肯定。有研究顯示紅景天同時具有抗血小板聚集、促進組織纖維蛋白溶酶的活性、降低血液的黏度、提高血液中血栓溶解、改善血液血流的藥理作用［11-12］，紅景天能夠提高機體耐缺氧和抗疲勞能力，提高抗寒力，降低整體耗氧量［13-14］。亦有研究表明，紅景天具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用［15］，在預(yù)防、治療腦部缺血和神經(jīng)退行性疾病方面具有潛在價值［16］。

本實驗結(jié)果顯示，與A組比較，B組血中ACTH和CORT水平明顯升高，同時中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT和NE的含量也有所增加。提示寒冷刺激可引發(fā)機體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸興奮。在應(yīng)激反應(yīng)中，一定范圍內(nèi)激素水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化可以幫助機體緩沖和適應(yīng)應(yīng)激刺激，因此開始時這是機體一種保護性反應(yīng)，但較高的激素水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的長時間作用可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害［17］。經(jīng)不同劑量參姜鎖陽益氣片治療后，大鼠血中ACTH和CORT水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT和NE的含量均有不同程度的下降。本研究結(jié)果還顯示，與F組比較，C組血中CORT水平和腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量升高。E組血中ACTH、CORT水平降低，而D組血中 ACTH、CORT水平和腦組織勻漿中5-HT、DA和NE含量與F組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示在抗寒冷護機體方面D組與F組療效最相近，從而初步確定了參姜鎖陽益氣片抗寒冷護機體的大致用量。

綜上所述，參姜鎖陽益氣片能夠通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸調(diào)節(jié)有關(guān)激素的水平，同時能調(diào)節(jié)相關(guān)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，從而調(diào)控體溫，起到對機體的保護作用。這可能是參姜鎖陽益氣片預(yù)防和治療寒凝氣滯血瘀證的又一作用機制。此外，通過與中藥大株紅景天比較，初步明確了參姜鎖陽益氣片抗寒冷護機體的劑量。

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