多發性硬化患者腦脊液磷酸丙糖異構酶抗體表達 與EDSS評分的相關性研究

郝烘玉，賀丹，劉輝，王婷婷

臨床研究

多發性硬化患者腦脊液磷酸丙糖異構酶抗體表達 與EDSS評分的相關性研究

郝烘玉，賀丹，劉輝，王婷婷

目的探討多發性硬化(MS)患者腦脊液磷酸丙糖異構酶(TPI)抗體表達水平與臨床神經功能障礙程度的相關性及其診斷價值。方法采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA方法)分別對23例MS患者(MS組)、17例其他中樞神經系統炎性疾病(OIND組)患者、13例非炎性疾病(ONIND組)患者的腦脊液TPI抗體表達水平進行檢測及比較，并分析TPI抗體表達水平與臨床擴展致殘量表評分(EDSS評分)的相關性。結果MS組、OIND組、ONIND組腦脊液TPI抗體OD值表達均數分別為(0.187±0.043)、(0.195±0.042)、(0.164±0.050)，3組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。腦脊液TPI抗體表達陽性率：MS組為3例(13.04%)、OIND組及ONIND組為0(P>0.05)。相關性分析顯示,MS患者臨床神經功能障礙EDSS評分與腦脊液TPI抗體OD值呈正相關(r=0.938，P=0.003)。結論腦脊液TPI抗體可以作為監測MS臨床療效及評估預后的實驗室指標，但目前暫不能認為其可以作為MS的輔助診斷性指標。

多發性硬化；磷酸丙糖異構酶；臨床擴展致殘量表評分；神經元及軸索變性

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是由多種因素共同參與的中樞神經系統自身免疫性疾病。從早期未引起注意的輕微癥狀進展為特征性臨床癥狀體征，潛伏期通常為1～10年，往往貽誤診治，因而是成年人中最常見的導致癱瘓的疾病之一。因此，早期診斷、治療對MS預后轉歸至關重要。國外最新研究顯示，MS患者腦脊液克隆B細胞核內含有單鏈可變區抗體基因片段。所表達抗體可與病變腦組織內分布于神經元及軸索內參與能量代謝的磷酸丙糖異構酶(triose phosphate isomerase，TPI)緊密結合，誘導神經元及軸索變性[1]。因此，推測TPI抗體有可能參與了MS神經元及軸索病變的過程。本研究旨在分析腦脊液TPI抗體表達與MS的相關性，為MS在神經元及軸索等灰質系統病變方面的深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年7月—2012年12月于河北醫科大學第二醫院住院確診符合2010年McDonald診斷標準的MS患者23例(MS組)，男8例，女15例，年齡22～59(35.4±9.2)歲；病程1～3個月，初次確診，以視力障礙或肢體活動障礙為主。另選取同期其他中樞神經系統炎性疾病(OIND組)患者17例，男6例，女11例，年齡22～55(36.1±10.0)歲；最終確診為病毒性腦炎患者13例、急性脊髓炎患者4例，均未合并意識障礙。非炎性疾病(ONIND組)患者13例,其中男5例，女8例，年齡21～63(38.1±13.7)歲；最終確診為吉蘭—巴雷綜合征患者1例、腦膜癌患者1例、靜脈竇血栓患者2例、腦血管病患者9例。征得MS患者同意后,由本人依據量表項目對自己的生活質量進行擴展致殘量表評分(EDSS評分)，視力障礙或肢體癱瘓的患者則由固定調查員協助進行。3組患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究均獲得全部受試對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀測指標及方法

1.2.1 腦脊液采集：留取患者入院后但未進行激素和/或丙種球蛋白治療前的首次腰椎穿刺術腦脊液5 ml，裝入離心管中于-80℃保存待測，避免反復凍融。

1.2.2 抗體檢測：采用ELISA方法檢測腦脊液內TPI抗體。步驟如下：以TPI(Sigma公司)2 μg/ml包被酶標板(Nunc公司)，4℃過夜。每孔加入3%牛血清白蛋白(bovogen公司)300 μl室溫條件下封閉2 h。洗板機(DG3090 南京華東電子)清洗5次，每次靜置10～20 s，每孔加入CSF 35 μl 25℃孵育反應3 h。洗板機清洗5次，加入1.5%BSA/PSB配制羊抗人IgG抗體(Sigma公司)(1∶1 000)100 μl，25℃孵育反應1.5 h。洗板機清洗5次，每孔加入TBM底物，KPL單組份顯色劑，25℃避光孵育反應30 min。每孔加入2 mol/L HCl終止液50 μl終止反應。酶標儀(DG5033A南京華東電子)在波長450 nm處讀取吸光度值(OD值)。對3組患者分析其與EDSS評分的相關性。

1.3 判斷標準 以ONIND組所測TPI抗體OD值的均數+2倍標準差為陽性判斷標準，高于此標準者為TPI抗體表達陽性。

2 結 果

2.1 TPI抗體OD值及陽性率比較 MS組、OIND組、ONIND組腦脊液TPI抗體OD值表達均數分別為(0.187±0.043)、(0.195±0.042)、(0.164±0.050)，3組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。腦脊液TPI抗體表達陽性率：MS組為3例(13.04%)、OIND組及ONIND組均為0，3組間TPI抗體陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 TPI抗體與EDSS評分的相關性分析 相關性分析得出MS患者EDSS評分(3.35±2.46)與腦脊液TPI抗體OD值(0.187±0.043)呈正相關 (r=0.938，P=0.003)。

3 討 論

3.1 腦脊液TPI抗體表達及臨床價值分析 目前國際上惟一公認的用于評估MS患者神經功能障礙的評分標準為EDSS評分。EDSS評分可作為早期MS患者生活質量的一個預測因子，從而指導臨床醫師早期關注患者生活質量并進行必要干預[2]，具有很強的臨床實用價值。本研究通過測定MS患者腦脊液TPI抗體表達水平，分析其與MS患者臨床EDSS評分的相關性得出：MS患者腦脊液TPI抗體表達水平與神經功能障礙程度具有正相關性(r=0.938，P=0.003)。TPI抗體在MS組表達陽性率為13.04%，OIND及ONIND組表達陽性率為0，3組間TPI抗體表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。研究結果表明：TPI抗體參與誘導了MS的級聯免疫反應，與MS神經元及軸索損傷密切相關。因此，腦脊液內TPI抗體的測定，可以作為監測MS臨床療效及評估預后的實驗指標。在臨床治療方面，有望為抗TPI抗體相關藥物的研發提供新的思路。有文獻報道35例確診MS及70例非MS患者的CSF及腦組織證實：MS患者腦脊液及病變區域腦組織內含有TPI抗體表達的增高[3]。分析TPI抗體的致病機制為：在中樞神經系統中，由于TPI廣泛與神經元細胞內細胞骨架中的微管結構緊密結合[3]。在神經元中，神經微管作為神經軸突胞漿運輸的主要通道，表面TPI的廣泛分布為胞漿運輸提供了足夠的能量支持，對神經元的發育及軸突的生長具有重要作用。在中樞神經系統自身免疫性疾病中，TPI抗體可直接與神經元內與微管結構緊密結合的TPI發生免疫反應，破壞TPI的酶活性，從而造成微管結構破壞，引起神經細胞凋亡，并通過激活補體和巨噬細胞引起神經元和軸突變性[4],大量研究顯示，TPI抗體表達增高現象普遍存在于多種自身免疫性疾病中，如非球形紅細胞溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等[5]。

然而，腦脊液TPI抗體的表達在MS與非MS疾病之間未見明顯差異，提示目前尚不能認為腦脊液TPI抗體可以作為MS患者輔助診斷的特異性及敏感性指標。分析研究結果與初期預測結果不符的可能原因包括：(1)TPI廣泛分布于外周及中樞神經系統，需進一步測定外周血TPI抗體表達水平，計算腦脊液與外周血TPI抗體測定差值，進行統計分析，進一步明確TPI抗體對MS的輔助診斷價值。(2)樣本量較少，對MS亞型分組不明確，對于不同MS亞型腦脊液TPI抗體表達水平的差異性尚需大量樣本資料進一步分析研究。

3.2 MS免疫機制研究進展 MS發病機制及臨床治療策略的研究主要是基于實驗室內所制備的變態反應性腦脊髓炎動物模型。其研究結果認為，MS是一種由輔助性T1細胞(Th1細胞)介導的攻擊中樞神經白質系統為主的自身免疫性脫髓鞘疾病。在此基礎上產生的臨床治療機制多集中在阻止Th1細胞進入中樞神經系統或將Th1細胞轉化為Th2細胞，減輕免疫炎性反應[6]。直至21世紀初期，基于MS灰質系統病變的研究成果，B細胞所參與的針對軸索和神經元的自身免疫反應在MS發病機制中的重要作用才開始得到重視。美國分子生物學專家通過研究MS患者腦脊液及尸檢腦組織內由B細胞表達的免疫球蛋白重鏈基因片段得出結果：MS患者體內存在增殖分化的B細胞。高分化的克隆B細胞首先在進展型MS患者腦脊液內被發現，且出現時間往往早于MS腦脊液寡克隆區帶的升高及異常影像學信號的形成。在MS疾病進展階段，鞘內寡克隆免疫球蛋白合成明顯增多，表明MS中樞神經系統內Th2依賴性B細胞及漿細胞的持續性增殖和分化[7]。推測TPI可能為驅動該增殖分化的相關抗原。克隆性漿細胞表達的抗體可與多數MS患者大腦神經元及軸突結合，結合部位主要包括軸膜、神經絲蛋白-L、腦衰蛋白反應性介導蛋白(CRMP)-5及神經節甘酯等[8]。病理學研究顯示，MS患者腦膜內存在異位的淋巴濾泡結構，該結構生發中心內含有增生分化的B細胞、漿細胞，T細胞以及樹突狀細胞[4]。B細胞亞群表現出明顯的VLA-4受體(淋巴細胞歸巢受體)內4亞基成分的高表達[3]，在B細胞遷移穿過血腦屏障過程中發揮重要作用。多數MS患者B細胞及漿母細胞在腦實質、腦膜和腦脊液內均存在明顯克隆擴增現象[9]。病理狀態下，Th2細胞依賴性抗原驅動鞘內B細胞進行增殖分化形成漿細胞，由漿細胞分泌的可溶性克隆IgG抗體構成診斷MS的重要寡克隆區帶[10]。MS患者腦脊液內IgG抗體表達增加以及應用抗CD-20抗體類藥物如利妥昔單抗治療的有效性均表明B細胞和漿細胞在MS的致病過程中發揮著重要作用。在此基礎上，如何更好地選擇性阻斷或抑制MS致病過程中Th2依賴性B細胞的持續增殖分化及抗TPI抗體相關藥物的研發，將有可能成為MS新的研究方向及臨床治療的新突破，為MS患者帶來曙光。

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050000 石家莊，河北醫科大學第二醫院神經內科

賀丹，E-mail:danhe@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.08.026

2014-02-27)