蘋果銹果類病毒山東文登峰山分離物的克隆

劉娟趙玲玲宋來慶姜中武,2*

1）山東省煙臺市農業科學研究院·265500 2）煙臺大學生命科學學院

蘋果銹果類病毒山東文登峰山分離物的克隆

劉娟1趙玲玲1宋來慶1姜中武1,2*

1）山東省煙臺市農業科學研究院·265500 2）煙臺大學生命科學學院

蘋果銹果病又名花臉病或裂果病，是嚴重影響蘋果生產的主要病毒病之一。廣泛分布于東北、西北、華北各蘋果產區，目前仍有擴大蔓延趨勢。其病原物為蘋果銹果類病毒（App1e scar skin viroid，ASSVd），主要侵染蘋果和梨，最新研究發現還可侵染桃、杏、櫻桃核果類果樹。感病蘋果因品種和環境條件的變化果實表現為5種病狀：銹果型、花臉型、銹果-花臉型、環斑型和綠點型，發病較重的果實發生畸形龜裂，大大降低果品的食用價值和經濟價值。對文登峰山地區富士蘋果進行ASSVd擴增和克隆，以期明確ASSVd在文登地區富士蘋果上的變異情況。

1 材料和方法

1.1 材料

2013年5月在文登峰山采集4株富士蘋果的嫩葉進行ASSVd擴增，樣品編號分別為D1、D2、D3、D4。

RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自Thermo公司；Taq DNA聚合酶（附10×Buffer，25 mmo1/L）、PMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN生化科技有限公司；大腸桿菌DH-5α為本實驗室保存菌株。

參閱Genebank中NC-001340序列設計特異引物：

反向引物：5′-CCGGCCTTCGTCGACGACGA-3′

正向引物：5′-TGAGAAAGGAGCTGCCAGCAC-3′用于擴增ASSVD的全長核苷酸序列，目的片段大小約為330 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

總RNA提取：采用北京艾德萊公司的RNA提取試劑盒（型號RN09）提取葉片總RNA，溶解于40 μL ddH2O中，貯存于-70℃冰箱中備用。

RT-PCR體系：反轉錄過程：參照Thermo反轉錄試劑盒說明書進行。PCR擴增體系：10× Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、Mg2＋2.0 μL、正反向引物各1 μL(10 umo1/L)、CDNA 1 μL、TaqE 0.15 μL，總體積25 μL。反應程序：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，58℃退后45 s，72℃延伸60 s，35次循環；72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

克隆測序：按照TIAN ge1 MidiPurification Kit說明書回收DNA目的片段，連接到pMD18-T載體上。取5 μL上述純化后的目的片段和pMD18-T克隆載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。經藍白斑篩選，挑取白色菌落進行PCR陽性克隆篩選。由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

將測序所得序列在GenBank中BLAST，然后用DNAMAN進行序列比對。

2 結果分析

2.1 ASSVd的RT-PCR檢測

以病樣中提取的總RNA為模板，利用設計好的引物進行RT-PCR反應，擴增得到大小約為330 bp的特異帶，與目的片段大小一致（圖1）。

2.2 變體序列比對

每個樣品選取3個陽性克隆進行測序，將測序結果在GenBank中BLAST，確定為ASSVd，并獲得5條ASSVd變體，以WS1～WS5表示，大小為330 bp、332 bp、333 bp、355 bp、358 bp。使用DNAMAN進行序列比對（圖2）。序列比對結果中可以得出，5條變體的差異位點主要發生在232位點以后（WS1、WS2、WS3）或257位點以后（WS4、WS5）；WS4、WS5分別在124～148和124～151有連續片段插入。

3 討論

目前，蘋果銹果病的主要傳播途徑有帶病枝條嫁接傳播、修剪工具造成的污染傳播、種子傳播等3種。尚無有效的藥物防止該病的發生，因而防治該病應以預防為主?？蓮囊韵聨讉€方面預防該病發生：建立新蘋果園時應遠離梨園150 m以上，避免與梨樹混栽；嚴格選用無毒接穗和砧木，培育無病毒苗木；不用修剪過病樹的剪、鋸修剪健樹。

通過研究ASSVd的變異，可為該病的防治、流行規律的判斷以及分子變異研究提供理論依據。本試驗從文登的4個富士樣品中，獲得5條不同于Genbank中已登錄的ASSVd新序列，并且5條變體的核苷酸序列存在較大差異，有關變體的致病性或毒性需要近一步研究。

泰山學者種業計劃項目，國家現代蘋果產業技術體系專項經費支持項目（CARS-28）

*責任作者,E-mai1:jiangzhongwu@163.com