醋酸棉酚對地塞米松作用后SD大鼠股骨頭組織形態學與基因表達的影響＊

林 顥，劉 軍，魏 波，曾 榮，王培永，向 昊，郭偉雄，祝兆波

（廣東醫學院附屬醫院骨科，廣東湛江524001）

股骨頭缺血性壞死是糖皮質激素應用過程中潛在的常見的嚴重并發癥之一［1-2］。文獻及臨床經驗證實糖皮質激素引起的骨壞死是在病理上表現為骨小梁結構變細，軟骨下骨微骨折，同時伴有骨髓腔內脂肪細胞分布增多，脂肪變大，脂質沉積等情況［3-4］。

11β-羥基類 固 醇 脫 氫 酶1（（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1，11β-HSD1）是骨組織中介導糖皮質激素（GC）活性的關鍵酶，在成骨細胞與破骨細胞均有表達［5］，其氧化與還原效應在骨組織中扮演著GC受體前調節機制的重要角色，是組織對GC應用的反應的關鍵環節［6］。糖皮質激素所引起的骨代謝異常與體內尤其是骨組織內11β-HSD1的活動緊密相關。成骨細胞不同的分化階段，細胞數量及功能狀態與骨穩態相關，受到局部糖皮質激素的調控。目前11β-HSD1與骨代謝異常之間關系機制尚待深入研究。

醋酸棉酚（gossypol acetate，GAA）是一種多元酚類化合物，文獻證實其可以通過糖基化其活性基團從而抑制11β-HSD1的功能［3］。本實驗采用GAA作用后觀察不同實驗組股骨頭形態學改變、骨組織中11β-HSD1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）／Run相關轉錄因子2（Runx2）、CCAAT區／增強子結合蛋白α（C／EBPα）表達特點，初步探討11β-HSD1抑制劑對激素應用所致的骨質異常的作用。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 11β-HSD1抗體、PPARγ抗體、Runx2抗體、C／EBPα抗體（北京博奧森生物技術有限公司），SP試劑盒（北京中杉生物有限公司），RNA檢測試劑（大連寶生物公司），引物11β-HSD1、PPARγ、Runx2、C／EBPα的序列（上海生工生物有限公司），GAA（北京中棉有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 模型制作及實驗分組 SD大鼠50只（約200 g，健康2月齡，雌雄不限），分為對照組，地塞米松（Dex）12周組，Dex＋GAA 12周組，Dex 20周組，Dex＋GAA 20周組，每組10只。對照組腹腔注射生理鹽水2 mL；其他組腹腔內注射Dex 10 mg／kg，每周2次，共注射12周或20周；Dex＋GAA 12周組，Dex＋GAA 20周組，同時予GAA 5 mg·kg-1·d-1灌胃；所有大鼠肌注青霉素，20萬U／只，每周1次，預防感染。

1．2．2 標本處理 藥物處理完成，取各組大鼠雙側股骨頭，一側置-80℃冰箱中凍存作實時定量RT-PCR檢測，另一側多聚甲醛中固定后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣3周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，作4μm厚連續切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察評估。

1．2．3 骨組織切片免疫組織化學法（SP法） 切片脫蠟、水化后，室溫下3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶；高壓下煮沸抗原修 復，加BSA封 閉 液；滴 加11β-HSD1、C／EBPα、Runx2、PPARγ一抗孵育4℃過夜；加生物素化山羊抗小鼠Ig G，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片。

所有切片均采用雙盲法作鏡下評估。HE染色按每個標本隨機選取4張切片，由3名醫師雙盲下進行評定。4×10倍鏡下觀察計算股骨頭內孔隙數目，骨小梁輪廓與分布。每張切片隨機選取5個100倍視野，用Imageplus6．0軟件分析計算100倍鏡下骨小梁面積比值與骨髓腔內脂肪細胞面積比值。免疫組織化學切片先選取染色陽性細胞（成骨細胞或脂肪細胞），陽性細胞染色為細胞質內出現棕黃色顆粒樣染色。每張切片隨機選取5個200倍視野，計算陽性細胞所占其總觀測細胞的百分率，得到面積比取平均值。

1．2．4 q RT-PCR法檢測股骨頭組織的11β-HSD1、PPARγ、Runx2、C／EBPα的表達

1．2．4．1 股骨頭組織RNA的抽提 凍存股骨頭組織，去除軟骨組織，置入研缽中加入液氮冷凍后，迅速研磨至呈粉末狀。加入RNAiso Plus 1 mL裂解作用5 min后4℃離心。加0．2 mL氯仿，充分搖勻后室溫下靜置5 min，4℃下12 000 r／min離心15 min，取上清液加入等量異丙醇后室溫下靜置10 min，4℃下12 000 r／min離心10 min析出沉淀，向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，4℃下12 000 r／min離心5 min，棄上清液保留沉淀，室溫下干燥10 min，溶解于20μL DEPC水中，取2μL稀釋成100μL后于紫外分光光度計下測定mRNA的含量與光密度值（OD）的比值。其余RNA存入-80℃擬行逆轉錄處理。

1．2．4．2 RNA逆轉錄，q RT-PCR方法檢測基因表達 取每組細胞RNA樣本，根據上述mRNA的含量計算1μg mRNA所需的適量RNA體積，加入：5×g DNA Eraser Buffer 2μL，g DNA Eraser 1μL，適量DEPC水構成10μL體系，室溫下放置5 min，將上述反應液10μL加入：5×Pri me Script Buffer 4 μL，Pri me Script?Enzy me 1μL，RT Pri mer Mix 1μL，DEPC水4μL直至20μL，反應條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃下保存。取各組逆轉錄產物2μL，加入SYBR?Premix Ex Taq 10μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，雙蒸水8μL形成20μL反應體系，置于PCR平板中，分置2個復孔行相關反應。反應條件按試劑盒說明操作，置于Light Cycler?480熒光定量PCR系統中測定。

1．3 統計學處理 采用SPSS11．0軟件進行統計學分析，實驗數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或Dunnet分析，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 應用Dex后股骨頭形態學改變分析 應用Dex后股骨頭松質骨小梁顯著減少，骨髓腔隙增加，改變隨應用時間延長加重；應用GAA后骨小梁面積所占比值減少明顯（圖1 A），組間比較差異有統計學意義（P＜0．01），至20周面積比值減少更加明顯（P＜0．01）；骨髓腔隙內脂肪細胞占面積比值則隨Dex應用增加，較對照組均存在顯著性改變，應用GAA后面積比例進一步增加（P＜0．01），見表1。

表1 各組形態學改變分析（±s）

表1 各組形態學改變分析（±s）

＊：P＜0．01，▲：P＜0．01，與對照組比較。

組別 骨小梁面積比值 骨髓腔內脂肪占面積比值對照組59．3±4．4 21．1±2．4 Dex12周組 55．0±3．4＊ 26．7±2．9▲Dex＋GAA 12周組 44．5±3．2＊ 31．6±3．4▲Dex20周組 45．6±3．1＊ 29．1±3．7▲Dex＋GAA 20周組 39．4±4．1＊ 37．1±3．1▲

2．2 免疫組織化學方法檢測及半定量結果分析 11β-HSD1主要表達在成骨細胞與脂肪細胞的胞漿內（圖1B）。脂肪細胞陽性染色細胞主要位于骨髓腔內，為中小型細胞型脂肪細胞；染色陽性成骨細胞主要位于骨小梁邊緣，呈扁平或柱狀。陽性成骨細胞及脂肪細胞數處理組較對照組隨時間延長增多。使用GAA陽性細胞數量隨時間上升（表2）。

C／EBPα陽性染色位于細胞質及細胞核內，成骨與脂肪細胞中均可見陽性表達且隨時間延長增加，陽性細胞比例數升高（圖1C）。PPARγ主要表達于骨髓脂肪細胞的細胞質及細胞核，以細胞質表達為主。隨Dex作用時間延長，染色陽性脂肪細胞比例明顯增加；GAA處理12、20周PPARγ表達增加，染色陽性細胞百分數升高，差異有統計學意義（P＜0．05）。見圖1D和表2。Runx2主要表達于成骨細胞核及胞漿中，以胞漿表達為主。小梁邊緣染色陽性成骨細胞較對照組數量減少，GAA處理12、20周后Runx2表達陽性細胞明顯下降，均P＜0．05（圖1E，圖2、3）。

表2 各組基因表達分析（相對比較法）

圖1 各組大鼠股骨頭切片HE、11β-HSD1、C／EBPα、PPARγ、Runx2免疫組織化學染色

圖2 各組不同Dex作用時間Runx2表達陽性細胞比較

圖3 各組不同Dex作用時間PPARγ染色陽性細胞比較

2．3 RT-PCR相對定量方法測定組織中11β-HSD1、PPARγ、Runx2、C／EBPαmRNA的表達 與對照組比較，其余各處理組對股骨頭組織中11β-HSD1、C／EBPα、PPARγmRNA增加，Runx2減少（P＜0．05）。GAA處理12、20周與相應Dex處理組比較，Runx2 mRNA表達明顯降低，C／EBPα、PPARγmRNA則上升更明顯（P＜0．05）。

3 討 論

糖皮質激素誘發股骨頭壞死的機制目前尚未完全闡明，存在多種學說［7］。骨組織局部激素活性水平調節異常可能是引起病變的關鍵因素之一。11β-HSD1是內源性糖皮質激素的關鍵調節酶，可以催化有生物活性的皮質醇與無活性11-脫氫皮質酮（以下簡稱為皮質酮）的相互轉化［8］；外源性激素作用時，誘發局部11β-HSD1表達與活性改變，對股骨頭形態學與基因表達變化有何影響，尚未明確［9］。本文研究結果表明較長時間應用Dex，SD大鼠股骨頭骨髓腔內脂肪細胞所占面積比例增高，脂肪體積增大，骨小梁稀疏，小梁占面積比明顯下降，提示長期應用糖皮質激素后該區骨與脂肪組織分布發生了改變，局部骨量下降。文獻報道應用糖皮質激素后骨髓脂肪細胞體積增大，細胞外脂質積聚等表現，最終發展成為骨壞死改變［3，5，10］。目前缺乏充足的證據來闡明其中機制。

本文中局部11β-HSD1表達增加，提示基于11β-HSD1激素水平的調節存在。免疫組織化學染色表明中小型脂肪細胞、成骨細胞中11β-HSD1的表達增加，同時PPARγ、C／EBPα表達增加，Runx2減少。Runx2控制成骨細胞各類特異性基因的表達（如骨保護素、骨鈣素等）；PPARγ具有促脂肪分化的能力［11］；C／EBPα主要分布在脂肪代謝旺盛的分化好的細胞中［8］。股骨頭組織中11β-HSD1表達存在相對差異，提示其功能與激素誘發的病理學改變存在著一定的關聯。Jorgensen等［12］發現11β-HSD1-／-小鼠有部分骨髓腔內脂肪組織的缺失，認為11β-HSD1對激素的增敏反應影響了骨髓脂肪細胞的形成。而To mlinson等發現11β-HSD1通過激活內源性皮質酮促進前脂肪細胞向脂肪細胞的分化。Sano等［13］也證實了對小鼠使用11β-HSD1抑制劑后，可以減少局部脂肪蓄積及脂肪細胞胰 島 素 的 敏 感 性。本 研 究 也 證 實11β-HSD1、C／EBPα、PPARγ等主要表達于骨髓組織中等大小脂肪細胞，其中激素組骨髓腔脂肪細胞11β-HSD1陽性指數升高的同時可見C／EBPα、PPARγ等表達增高現象，表明Dex作用下，骨組織11β-HSD1的表達改變可能通過影響C／EBPα、PPARγ表達而影響了骨髓組織中中小型脂肪細胞的分化過程，而在激素誘發的骨組織病理變化中起到重要的影響作用。

對于成骨細胞而言，11β-HSD1對其的作用與其不同的分化階段有關。在成骨細胞分化早期，由于需要糖皮質激素的量開始明顯增多，這時內源性糖皮質激素的作用是有益于成骨的；至分化晚期后，內源性糖皮質激素則是有害于成骨細胞，使其功能下降［14］。本實驗觀察到用超生理劑量的Dex干預后，成骨細胞11β-HSD1的表達緩慢上升，同時Runx2的表達量下降，C／EBPα表達量微增。在長期的Dex作用下，Dex與GR結合后，可以與增加的C／EBPα協同調控，共同促進成骨細胞11β-HSD1表達［15］，增加了激素的激活，使局部活性糖皮質激素水平增加，形成正反饋作用，加重了成骨代謝紊亂。

GAA對11β-HSD1的活性基團進行糖基化后起到抑制其活性的作用［3］。本實驗發現，隨11β-HSD1活性的抑制，股骨頭組織成骨功能受到抑制，成脂性基因表達明顯增強，表現為免疫組織化學分析中Runx2陽性指數進一步下降，PPARγ、C／EBPα陽性指數則進一步上升。此基因表達的改變在骨髓脂肪組織中尤為顯著。這從另一個方面說明前述觀察到的脂肪成分所占面積增加的病理改變一致。提示在一定程度上骨質減少與成分比例的變化與激素作用后誘導的基因表達改變相關。然而，應用GAA后，骨質局部脂肪組織占優勢的病理改變理論上應該得到抑制，但本文卻沒有觀察到這一結果，可能存在以下原因，人工合成的激素Dex不經過11β-HSD1脫氫激活，但誘導其在組織內的表達，也有可能是Dex直接與細胞內受體結合起作用，而不經過11β-HSD1調節這一環節；再者，受到藥理學劑量Dex作用后而引起的脂肪組織的積聚或分化增強，還存在其他調節通路，單純骨組織局部的調節激活不能完全阻斷局部脂肪組織增殖性改變。由于體內影響因素眾多，相關機制研究有待于進一步展開，以闡明主導該病理改變的主要機制。

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