過氧化物酶體增殖物激活受體γ在哮喘患者淋巴細胞中的表達

張春容，趙 燕，王導新△

（1．重慶醫科大學附屬永川醫院急診科 402160；2．重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科 400016）

支氣管哮喘是慢性氣道炎癥性疾病，其發病過程涉及多種細胞及細胞組分。其中，肺組織內原有的Th1／Th2免疫應答失衡，主要是Th2細胞介導的免疫應答增強致氣道嗜酸性粒細胞聚集增多和氣道高反應性，是重要發病機制［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated recep-tor，PPAR）屬于核激素受體超家族成員，分為3個亞型，其中，PPARγ具有調節脂肪代謝、抗炎和調節免疫等多種生物學效應［2-3］。且其在肺內多種細胞如樹突狀細胞、巨噬細胞等廣泛表達，是肺內炎癥和免疫調節可能的作用靶點。本實驗擬探討哮喘患者淋巴細胞PPARγ表達的變化，旨在從哮喘發病的機制入手尋求新的治療藥物，阻止疾病進展，使哮喘患者獲得更佳的臨床療效。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2012年10月至2013年6月在重慶醫科大學附屬永川醫院住院治療的42例哮喘患者為研究對象（哮喘組）。入選標準：符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組的診斷標準，即（1）有典型的哮喘病史大于1年；（2）支氣管激發試驗陽性或支氣管舒張試驗陽性。排除標準：（1）合并嚴重的心、肝、腎功能不全；（2）合并支氣管擴張、肺結核、塵肺等慢性肺病疾病者；（3）合并惡性腫瘤；（4）病程中病情加重，需氣管插管輔助通氣和重癥監護。沙丁胺醇為受試者惟一急救藥物。將同期在本院體檢的40名健康者作為對照（健康對照組）。排除標準：（1）身體各部位有可疑感染病灶；（2）血常規白細胞計數大于10×109個／L，或炎癥細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞）大于參考值上限。兩組受試者的基線資料見表1。

表1 受試者一般資料

1．2 方法

1．2．1 病史采集內容 采集內容包括年齡、性別、病程、吸煙史、家族史等。住院患者采用甲潑尼龍40～100 mg／d治療1～5 d，在糖皮質激素治療前、治療后2 d和治療后4 d分別留取相應標本進行檢測分析。

1．2．2 定量聚合酶鏈式反應（Q-PCR）檢測外周血淋巴細胞PPARγmRNA表達情況 收集40名健康受試者外周血標本，1∶1加入淋巴細胞分離液，收集白膜層。使用TAKARA試劑盒提取42名哮喘患者治療前，治療后2 d和治療后4 d淋巴細胞總RNA。PPARγ基因上游引物5′-CAA GCC CAG TCC TTT CTG TG-3′，下 游 引 物5′-AGT GAA GGA ATC GCT TTC CG-3′。β-actin上游引物5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，下游引物5′-AGG AAG GCT GGA AGA GTG C-3′。按美國羅氏公司Syber GreenⅠ試劑盒說明書操作，95℃預變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，共42個循環。

1．2．3 痰誘導及標本收集 按文獻［4］推薦方法進行誘導痰細胞學分類和計數。入選患者誘導前15 min吸入沙丁胺醇400μg，然后給予超聲霧化吸入3%高滲鹽水，2～5 min后，指導患者主動排痰，并收集痰液。加入4倍體積的0．1%二硫蘇糖醇，37℃水浴10 min，2 000 r／min離心5 min。細胞沉淀涂片，瑞氏-吉姆薩混合染液染色10 min，光鏡下對不少于400個非鱗狀上皮細胞進行分類和計數。細胞分類的正常上限：嗜酸性粒細胞比例為0．5%，中性粒細胞比例為65%。誘導痰上清收集凍存于-70℃冰箱用于細胞因子白細胞介素-5（IL-5）檢測，酶聯免疫吸附法測定IL-5水平。

1．3 統計學處理 采用Graphpad5．0軟件進行統計學分析和作圖。計量資料以±s表示，多組計量資料方差齊時組間比較采用單因素方差分析；方差不齊時采用秩和檢驗分析。雙側檢驗，檢驗水準α＝0．05，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 患者治療前后PPARγ基因表達特點 以健康對照組淋巴細胞中PPARγ基因擴增平均CT值為比較基準，按2-△△CT法計算治療前、治療后2 d和治療后4 d各組平均的PPARγ基因表達倍數。與健康對照組比較，哮喘組患者在治療前PPARγ表達最低，治療后PPARγ基因表達逐步上調。見圖1。

圖1 PPARγmRNA在受試者淋巴細胞中的擴增倍數

2．2 患者治療前后誘導痰上清IL-5水平 健康對照組誘導痰上清IL-5水平極低，部分標本低于試劑盒檢測下限不能測出。哮喘組患者治療前和治療后2 d誘導痰上清仍能測出較高水平的IL-5，兩組之間差異無統計學意義（P＞0．05）。在治療后4 d，IL-5水平顯著下降。見圖2。

2．3 患者治療前后誘導痰嗜酸性粒細胞比例分析 健康對照組人群誘導痰嗜酸性粒細胞比例均在正常參考值范圍內。哮喘組患者痰嗜酸性粒細胞比例在治療前最高，治療后2 d逐漸下降，治療后4 d顯著降低。見圖3。

圖2 ELISA檢測受試者誘導痰上清中IL-5水平

圖3 受試者誘導痰中嗜酸性粒細胞比例

3 討 論

哮喘自身發病機制復雜，固有免疫缺陷、適應性免疫應答失衡和植物神經功能紊亂都一定程度參與疾病的發生進展。此外，文獻報道性別、肥胖、吸煙、感染等多種因素均對哮喘發病有影響［4-7］。有必要從哮喘發病的根本免疫機制入手，尋求可能有效的治療靶點或方案?；罨腡h2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13，參與炎癥細胞的募集、氣道高反應性的誘發、黏液高分泌和氣道重塑等多個哮喘病理過程。文獻報道可根據哮喘患者痰中IL-5 mRNA水平劃分病情輕重等級，因此本實驗選擇IL-5為Th2細胞功能的檢測指標［8］。

實驗結果顯示，哮喘急性發作時，誘導痰中嗜酸性粒細胞比例增加同時誘導痰上清中檢測到IL-5水平顯著增高。兩項指標的變化趨勢一致。Th2細胞通過分泌IL-5等細胞因子募集嗜酸性粒細胞至氣道，參與哮喘的發病。而嗜酸性粒細胞作為主要的效應細胞，聚集在氣道和血管周圍，維持哮喘的慢性炎癥狀態，并誘發氣道高反應性，是哮喘急性發作的重要原因。也有文獻報道，IL-5不僅對嗜酸性粒細胞有募集作用，還能抑制凋亡，將其存活時間由4 d延長至2周［9］。

分離外周血淋巴細胞進行基因表達水平檢測，結果提示哮喘組患者PPARγmRNA表達水平在入院時顯著低于健康對照組。經過治療，其表達逐漸增高，甚至有部分患者在治療后4 d已表現出比健康對照組更高的水平。PPARγ的表達與嗜酸性粒細胞比例和IL-5水平的變化趨勢相反。推測PPARγ的抗炎作用可能是通過抑制Th2細胞功能，降低IL-5的分泌實現的。這同周煒等［10］的報道一致：支氣管哮喘及喘息性肺炎患兒外周血PPARγ表達減少，可使炎癥信號轉導增強，導致患兒哮喘發作和發生喘息。分離培養哮喘患者外周血T淋巴細胞，使用以羅格列酮為代表的噻唑烷二酮類藥物特異激活PPARγ后，IL-4分泌水平較健康者顯著降低，與T細胞轉錄信號相關的p-STAT6蛋白表達明顯降低，且兩者表達水平呈正相關［11］。

在用卵清蛋白致敏和激發的小鼠哮喘模型中，羅格列酮通過核因子-κB（NF-κB）通路抑制T細胞因子和血清相應卵清蛋白抗體的產生，并能降低氣道高反應性和氣道炎癥水平，發揮保護作用［12］。雖然已有不少研究證實激活PPARγ對哮喘動物模型有確切的保護作用，但仍存在一些局限。PPARγ作為核受體超家族的一員，能調控多種細胞的增殖分化?；诖?，尚無法在PPARγ基因敲除動物體內驗證其對哮喘的保護作用。仍需要大量關于PPARγ與哮喘的基礎研究和臨床研究進一步驗證可能的作用機制和作用效能。同時注意噻唑烷二酮類藥物對血糖的影響。

綜上所述，哮喘患者急性發作時Th2細胞激活，分泌高水平IL-5，募集嗜酸性粒細胞至氣道周圍聚集。隨著PPARγ表達水平的上調，哮喘的氣道炎癥程度降低，IL-5分泌減少。PPARγ對哮喘的保護作用可能是通過抑制效應性T細胞的功能實現的。PPARγ是哮喘患者可能的新治療靶點，其激動劑有望用于臨床，使患者獲得良好的臨床控制。

［1］Jacobsen EA，Zellner KR，Colbert D，et al．Eosinophilsregulate dendritic cells and Th2 pulmonary immune responses following allergen provocation［J］．J Immunol，2011，187（11）：6059-6068．

［2］Glass CK，Saijo K．Nuclear receptor transrepression pathways that regulate inflammation in macrophages and Tcells［J］．Nat Rev Immunol，2010，10（5）：365-376．

［3］Kim SH，Hong JH，Lee YC．Ursolic acid，a potentialPPARγagonist，suppresses ovalbumin-induced airwayinflammation and Penh by down-regulating IL-5，IL-13，and IL-17 in a mouse model of allergic asthma［J］．Eur J Pharmacol，2013，701（1／3）：131-143．

［4］趙燕，程曉明，林科雄，等．哮喘急性加重和糖皮質激素治療對誘導痰炎癥細胞分類及表型的影響［J］．第三軍醫大學學報，2013，35（18）：1968-1971．

［5］Krishnamoorthy N，Khare A，Oriss TB，et al．Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory Tcell function and increases susceptibility to allergic asthma［J］．Nat Med，2012，18（10）：1525-1530．

［6］Pietinalho A1，Pelkonen A，Rytil?P．Linkage betweensmoking and asthma［J］．Allergy，2009，64（12）：1722-1727．

［7］Scott HA，Gibson PG，Garg ML，et al．Airway inflammation is augmented by obesity and fatty acids in asthma［J］．Eur Respir J，2011，38（3）：594-602．

［8］Islam SA，Chang DS，Colvin RA，et al．Mouse CCL8，aCCR8 agonist，promotes atopic dermatitis by recruitingIL-5＋T（H）2 cells［J］．Nat Immunol，2011，12（2）：167-177．

［9］宋曉丹，張明，歐維琳．支氣管哮喘患者嗜酸性粒細胞凋亡延遲及其影響因素研究進展［J］．實用兒科臨床雜志，2010，22（22）：1753-1755．

［10］周煒，季偉，儲矗，等．過氧化物酶體增殖活化受體-γ在兒童喘息性疾病的表達及意義［J］．中國小兒急救醫學，2013，20（4）：406-407．

［11］楊海華，王文軍，向旭東，等．PPAR-γ激動劑對哮喘急性發作期患者T淋巴細胞磷酸化STAT6影響的體外實驗研究［J］．中國呼吸與危重監護雜志，2008，7（5）：346-349．

［12］Park SJ，Lee KS，Kim SR，et al．Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma agonist down-regulates IL-17expression in a murine model of allergic airway inflammation［J］．J Immunol，2009，183（5）：3259-3267．