結核桿菌熱休克蛋白70作為表位肽載體體外誘導HBV特異性免疫應答＊

羅 莉，何 松，羅 娜，彭明利

（1.重慶市渝北區人民醫院消化內科 401120；2.重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科 400010；3.重慶醫科大學附屬第一醫院急診科 400016；4.重慶醫科大學病毒性肝炎研究所 400016）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一種世界性的傳染病，全球約有3.5億 HBV慢性攜帶者，嚴重危害人類健康［1］。而主要組織相容性復合物MHC－Ⅰ限制的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）在預防、控制、清除HBV感染中起著核心作用［2－3］。已有研究運用結核桿菌熱休克蛋白70（TB.HSP70）作為表位肽載體制備疫苗免疫治療 HBV感染［2］。HBV18－27核心肽的CTL表位在大多數HBV病毒株中高度保守，與HLA－A2.1e有高度親和力，能與幾種 HLA－A2的亞型產生交叉反應［4］。已有研究表明，HSP70－HBcAg（18－27）－CTL 融合蛋白和HSP70－HBcAg（18－27）－CTL復合物可有效誘導 HBV 特異性細胞免疫反應，HBcAg（18－27）的增殖活性較弱，它對淋巴細胞的特異性殺傷作用影響不大［2］。因此，本研究借助結核桿菌HSP70作為表位肽載體，設想將 HBcAg HLA－A2限制性CTL表位 HBcAg（18－27）融合到TB.HSP70的C端，并引入Th和B表位，應用Pichia pastoris酵母分泌表達目的蛋白，體外考察疫苗對慢性HBV感染者外周血淋巴細胞和外周血來源的樹突狀細胞的作用，進行免疫學功能研究，為慢性乙型肝炎（CAH）的治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 Pichia pastoris GS115表達宿主菌、表達質粒pPIC9和pPIC9K、重組人白細胞介素（IL）－2為Invitrogen公司產品；含TB.HSP70基因的表達載體H37Rv、HepG2.2.15細胞為本實驗室構建、保存；限制性內切酶（大連寶生物公司）；ATP－agarose（美國Sigma公司）；辣根酶標記的羊抗鼠IgG抗體（北京康為公司）；鼠抗－TB.HSP70單克隆抗體、FITC標記的鼠抗CD1a、CD86、HLA－DR單克隆抗體及同型對照抗體（Sigma公司）；FITC標記的鼠抗CD40單克隆抗體（Abcam公司）；檢測IL－12p70、IL－1β、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）和干擾素－γ（IFN－γ）的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（深圳晶美公司）；淋巴細胞分離液（天津TBD公司）；PCR引物由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達質粒的構建與鑒定 以結核分枝桿菌H37Rv作為模板，PCR法擴增含TB.HSP70編碼序列的DNA片段（1 900bp），在XhoI和EcoRI位點將擴增的TB.HSP 70基因亞克隆到pPIC9表達載體上獲得畢赤酵母質粒pPIC9－HSP70。然后將來自pPIC9－HSP70質粒的 HSP70基因亞克隆到pPIC9K載體的SacI和HpaI位點上獲得pPIC9K－HSP70 質 粒 （PIC9／P1）［2，5］。 以 pPIC9－HSP70 為 模板，將 HBcAg（18－27）融合到 TB.HSP70的 C端，并引入 Th和B表位，按照上述方法經雙酶切后亞克隆到pPIC9K載體上，構建質粒 pPIC9K－HSP70－HBcAg（18－27）（PIC9／P2）、pPIC9K－HSP70－PreS2B（18－24）－PreS2Th（37－53）－HBcAg（18－27）（PIC9／P3）、pPIC9K－HSP70－PreS2B（18－24）－Th（830－843）－HBcAg（18－27）（PIC9／P4）［2］。將上述構建的質粒進行 XhoI和EcoRI雙酶切和測序鑒定。

1.2.2 重組蛋白的表達、純化與鑒定 按照Invitrogen公司的Pichia pastoris expression system表達系統手冊，用SacI酶線性化各質粒，電轉化宿主菌GS115［2］，重組轉化子分別標識為GS115／P1、GS115／P2、GS115／P3、GS115／P4，MD平板選擇性培養，PCR方法快速篩選每種陽性轉化子6～10株。將宿主菌培養在OD600為1.0的BMMY培養基中，用0.5%的甲醇誘導表達3d。將表達上清液用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進行電泳后，考馬斯亮藍染色觀察有無目的條帶。然后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）印跡膜上，用鼠抗－TB.HSP70單克隆抗體和辣根酶標記的羊抗鼠IgG抗體孵育，蛋白免疫印跡法（Western blot）鑒定表達的目的蛋白［2，5］。將表達量高的菌株接種至1L培養基中誘導表達3d，10 000r／min離心30min，收集的上清液經50×103的濾膜超濾濃縮后，去除小分子和鹽，其濾液放置ADP－agarose柱中分離純化，用1mmol／L的 MgATP預先調節至pH 7.0洗脫，然后在洗脫液中加入乙二胺四乙酸（EDTA）至終濃度2 mmol／L，進行磷酸鹽透析得到的洗脫液包含純度超過95%的目的蛋白 HSP70（P1）、HSP70－HBcAg（18－27）（P2）、HSP70－PreS2B（18－24）－PreS2Th（37－53）－HBcAg（18－27）（P3）、HSP70－PreS2B（18－24）－Th（830－843）－HBcAg（18－27）（P4）［2］。

1.2.3 體外考察重組蛋白對慢性乙型肝炎患者外周血來源的樹突狀細胞生物學活性的影響 按乙型肝炎治療指南的標準選取慢性乙型肝炎志愿者（HLA－A2）24例，每組6例，與健康志愿者（CTR）作對照，取20mL外周血，肝素抗凝，常規分離外周血單個核細胞，放置37℃，5%CO2培養箱中用RMIP1640完全培養基（含10%胎牛血清）貼壁培養2～4h。用RMIP1640培養基清洗細胞3次，洗脫未貼壁的細胞（混合淋巴細胞），得到的貼壁細胞在 GM－CSF（1 000U／mL）和IL－4（500U／mL）的作用下誘導成樹突狀細胞［2］。用RMIP1640培養基重懸樹突狀細胞，調節細胞濃度為1×106個／mL置于96孔培養板中培養至5d時，分別加入100μg／mL重組蛋白P1、P2、P3各0.1mL（終濃度為10μg／mL），共同孵育2d，以培養基為空白對照，行流式細胞術評估樹突狀細胞成熟度，包括檢測 CD1a、CD40、CD86、HLA－DR表達［6］。重組蛋白負載樹突狀細胞2d后，ELISA法檢測細胞因子分泌情況IL－12p70、IL－1β、TNF－α（pg／mL）。

1.2.4 體外考察重組蛋白誘導淋巴細胞增殖 樹突狀細胞按照上述方法分離培養5d后，用RMIP1640培養基重懸樹突狀細胞，調節細胞濃度為1×106個／mL置于96孔培養板中，每孔100.0μL，分別加入100.0μg／mL 重組蛋白P1、P2、P3各0.1mL（終濃度為10.0μg／mL），共同孵育5d。在樹突狀細胞培養過程中，貼壁孵育后，取未貼壁的細胞（自體淋巴細胞），用RMIP1640完全培養基，含10%的胎牛血清和100U重組人IL－2培養，以2×106個／mL的細胞濃度置于24孔培養板中，分別加入10μg P1、P2、P3刺激，共同培養5d，收集細胞并用無血清1640培養基洗滌2次。負載重組蛋白的樹突狀細胞以1∶10的比例與洗滌后的自體淋巴細胞混合置于37℃，5%CO2培養箱中共同孵育3d，以培養基為空白對照，每孔加入TdR－3H1μCi，18h后收集細胞，檢測cmp值［6］。在細胞共同孵育3d后收集細胞培養上清液，用ELISA檢測IFN－γ分泌。

1.2.5 體外考察重組蛋白誘導HBV特異性細胞毒活性 將樹突狀細胞與10μg重組蛋白P1、P2、P3共同培養5d后，再以1∶10比例與自體淋巴細胞共同孵育7d作為效應細胞，換液，用前24h重組蛋白P1、P2、P3再刺激1次。以HepG2.2.15細胞（表達HBsAg和HBeAg）為靶細胞，將2×106個靶細胞在含20%胎牛血清的1640培養基中用100μCi Na51Cr O4于37℃標記1h，再用無血清的1640培養基洗滌細胞。在1×104個／孔的靶細胞中按不同的效靶比（10∶1、20∶1、40∶1、80∶1）加入效應細胞于37℃10%胎牛血清中孵育4h，取100 μL上清液應用經典51Cr法檢測細胞毒活性。殺傷率＝100×（實驗組釋放－自然釋放）／［最大釋放（0.1mmol HCl）－自然釋放］。在所有實驗中自然釋放小于15%最大釋放［6］。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，每次獨立的實驗重復操作3次，計量資料以x±s表示，采用Student′s t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 酵母表達質粒的構建與鑒定 構建的質粒經XhoI和EcoRI雙酶切后，得到相應的目的片段（圖1），同時測序結果也顯示表達載體構建成功，表位序列準確地融合在HSP70的C端，質粒分別標識為PIC9／P1、PIC9／P2、PIC9／P3、PIC9／P4。

2.2 重組蛋白的表達、純化與鑒定 實驗表明重組蛋白P1、P2、P3能夠順利地分泌表達（在70×103處均有一條帶），而帶有破傷風毒素通用輔助性T細胞識別表位Th830－843融合蛋白P4不能分泌表達（圖2A），經實驗反復證實，但胞內檢測有表達，可能Th830－843表位的引入干擾了該載體分泌信號的正確切割。將表達量高的菌株接種至1L培養基中誘導表達3 d，離心，上清液經50×103的超濾濃縮后，用ADP－agarose介質親和層析得純度超過95%的目的蛋白，搖瓶實驗顯示目的蛋白表達量大于120mg／L（圖2B）。

圖1 表達質粒的酶切鑒定

2.3 重組蛋白刺激慢性乙型肝炎與健康者外周血來源樹突狀細胞表面分子表達 體外重組蛋白誘導樹突狀細胞成熟，促進細胞因子分泌，樹突狀細胞在培養5d時，分別加入P1、P2、P3，濃度為10μg／mL，共同孵育2d，以培養基為對照，行流式細胞術檢測樹突狀細胞CD1a、CD40、CD86、HLA－DR表達，結果見表1。樹突狀細胞經 P1、P2、P3刺激后，CD1a、CD40、CD86均明顯提高，CD1a乙型肝炎患者較健康者低，CD40、CD86二者差異無統計學意義（P＞0.05），HLA－DR差異無統計學意義（P＞0.05），且 HLA－DR的表達在抗原刺激前后差異無統計學意義（P＞0.05），重組蛋白負載樹突狀細胞2d后，ELISA法檢測細胞因子分泌情況（圖3），P1、P2、P3均能誘導樹突狀細胞分泌 Th1型細胞因子（IL－12p70、IL－1β、TNF－α），有利于Th0向Th1的極化。

表1 重組蛋白刺激慢性乙肝與健康者外周血來源樹突狀細胞表面分子表達（%pos）

圖3 重組蛋白刺激慢性乙型肝炎外周血來源樹突狀細胞因子分泌情況

圖4 重組蛋白負載樹突狀細胞刺激淋巴細胞增殖和IFN－γ的分泌

2.4 體外重組蛋白誘導淋巴細胞增殖和IFN－γ釋放 將負載重組蛋白的樹突狀細胞按1∶10與自體淋巴細胞孵育3d，TdR－3H摻入法檢測淋巴細胞的增殖情況（圖4A）和ELISA檢測IFN－γ分泌（圖4B），結果顯示P1、P2、P3明顯刺激淋巴細胞增殖和釋放IFN－γ。

2.5 體外重組蛋白誘導HBV特異性細胞毒活性 以HepG2.2.15細胞（表達HBsAg和HBeAg）為靶細胞，在體外應用經典51Cr法檢測重組蛋白（P1、P2、P3）誘導 HBV特異性細胞毒活性（圖5），其結果顯示P3能引起較強的細胞毒活性，健康者較乙型肝炎患者強，在效靶比為80∶1時，前者為65%，后者為44%，這可能與乙型肝炎患者T細胞功能缺陷有關，而單純的TB.HSP70（P1）基本沒有細胞毒性。以HepG2和HEN細胞為靶細胞，P3幾乎無細胞毒性。

圖5 重組蛋白誘導自身淋巴細胞HBV特異性細胞毒活性

3 討 論

本研究借助TB.HSP70作為表位肽載體，選用了應用最多的 HBcAg HLA－A2限制性 CTL表位 HBcAg（18－27），將HBcAg（18－27）融合到TB.HSP70的C端，并引入Th和B表位，應用Pichia pastoris酵母分泌表達目的蛋白HSP70（P1）、HSP70－HBcAg（18－27）（P2）、HSP70－PreS2B（18－24）－PreS2Th（37－53）－HBcAg（18－27）（P3），體外考察這些疫苗對慢性 HBV感染者外周血淋巴細胞和外周血來源的樹突狀細胞的作用，表明HSP70可作為HBV HBcAg細胞毒性CTL表位肽載體，提高CTL表位肽的免疫原性，特別是含有B、Th表位的P3能更好地激活HBV特異性免疫應答。

作者之前的研究證實HBcAg（18－27）有較弱的增殖活性，它對淋巴細胞的特異性殺傷作用影響不大［2，7］。而本研究觀察了重組蛋白（P1、P2、P3）在體外誘導樹突狀細胞成熟、淋巴細胞增殖以及HBV特異性細胞毒活性情況。其結果顯示P1、P2、P3能上調CD1a、CD40、CD86表達，誘導未成熟的樹突狀細胞分泌大量的IL－12p70、IL－1β、TNF－α，有利于 Th0向 Th1的極化，促進樹突狀細胞成熟，增強樹突狀細胞抗原遞呈能力，同時促進淋巴細胞增殖和釋放IFN－γ，而且P3最能有效激活自體淋巴細胞成為細胞毒活性細胞，而單獨的HSP70沒有殺傷活性，不能有效引起機體特異性免疫應答。這些實驗結果表明HSP70作為表位肽載體大大增強了CTL表位肽的免疫原性，特別是引入B、Th表位，可更有效地誘導HBV特異性免疫應答。其可能的原因為：（1）HSP70（P1）和融合蛋白（P2、P3）結合樹突狀細胞能上調CD1a、CD40、CD86表達，誘導樹突狀細胞分泌產生高水平的 Th1 型細胞因子（IL－12p70、IL－1β、TNF－α），其中IL－12在誘導Th1極化中起關鍵作用，另外誘導釋放的IFN－γ也有利于Th0向Th1的極化，從而促進樹突狀細胞成 熟，增 強 其 免 疫 活 性［2，8－9］。（2）HSP70特 異 性 結 合CD40，作用于單核細胞、樹突狀細胞等激活免疫系統，促進樹突狀細胞釋放CC趨化因子如CCL3（MIP－1a）、CCL4（RANTES）。通過CD40信號可以上調抗原呈遞能力，增加共刺激分子CD80、CD86和CD58的表達，使樹突狀細胞能向CTL啟動［10］。因此樹突狀細胞通過刺激T細胞、促進CD40表達，以及與CD40L的交聯作用誘導 MHC－I限制性抗原特異性CD8＋T細胞反應［3，11］。

本研究通過體外考察表明TB.HSP70可作為HBV HB－cAg細胞毒性CTL表位肽載體，提高CTL表位肽的免疫原性，而且含有B和Th表位的P3能更好地激活HBV特異性免疫應答，這為CAH的免疫治療開辟新的途徑。Floto等［12］研究表明TB.HSP70通過CCR5受體作用于樹突狀細胞，誘導樹突狀細胞聚集，促進樹突狀細胞與T細胞形成免疫應答，而P3是否也通過CCR5受體作用于樹突狀細胞，這將在后續研究中進一步探討。

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