PD-L2在宮頸鱗狀細胞癌的表達及對外周血T細胞凋亡的影響＊

耿衛樸，徐 曼，張 燕，陳 瑜，黃文煉，王婷婷

（重慶醫科大學病理教研室／分子與腫瘤研究中心 400016）

我國宮頸癌的發病率近年來逐漸增高并出現年輕化趨勢，宮頸鱗狀細胞癌是最主要的組織學類型。宮頸鱗狀細胞癌的發生與乳頭瘤病毒感染密切相關，但病毒感染后僅少部分病例發展為癌，提示癌變細胞未能被局部微環境的T細胞識別和清除。宮頸癌微環境出現T細胞免疫水平下降與宮頸局部出現負性共刺激分子如B7家族成員、調節T細胞浸潤以及白細胞介素（IL）-10和轉化生長因子β（TGF-β）水平增高等因素有關。PD-L2是共刺激分子B7家族成員之一，它與T細胞表面的PD-1受體結合后通過PD-L2／PD-1信號途徑影響T細胞增殖及分泌細胞因子，負性調節T細胞活化并促進T細胞凋亡，從而抑制人體的抗腫瘤免疫［1-2］。癌細胞表達PD-L2還能促進癌細胞逃避宿主機體的免疫監視［3］。文獻報道PD-L2在多種惡性腫瘤如肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、子宮頸癌和卵巢癌細胞異常表達，PD-L2與腫瘤內CD8＋T細胞減少相關，在腫瘤原發部位及其轉移的淋巴結內均能抑制效應T細胞的抗腫瘤免疫功能，而且癌細胞表達PD-L2與患者預后差密切相關［4-6］，但對PD-L2調節T細胞凋亡的作用目前尚未見報道。為進一步闡明PD-L2／PD-1信號途徑在調節子宮頸鱗狀細胞癌患者抗腫瘤T細胞免疫中的作用，本實驗采用免疫組織化學方法觀察PD-L2在宮頸鱗狀細胞癌組織的表達，分析PDL2表達與患者臨床病理特征的相關性，并通過體外實驗觀察了可溶性PD-L2蛋白對宮頸癌患者外周血活化T細胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1．1 一般資料 正常宮頸組織30例，高級別宮頸上皮內瘤變（CIN）Ⅱ、Ⅲ級30例和宮頸鱗狀細胞癌60例均取自重慶醫科大學病理教研室2009～2010年的病理標本。患者年齡32～65歲，平均43．12歲。免疫組織化學實驗采用10%中性甲醛固定、石蠟包埋組織。外周血取自重慶醫科大學第一附屬醫院婦產科未經化療的宮頸鱗狀細胞癌患者。采血前已得到患者及其家屬的同意，并通過醫院倫理委員會審批。

1．2 主要試劑 兔抗人PD-L2（bs-1868 R）和鼠抗人PD-1（bs-1867R）購自北京博奧森生物技術有限公司；重組人PD-L2活性蛋白（10292-H08 H）購自北京Sino Biological公司；PV-6000試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物有限公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；Annexin V-PE／7-AAD凋亡試劑盒購自南京凱基生物技術有限公 司；小 鼠Ig G1-PE（No．12-4714）、Ig G1-FITC（No．11-4714）、鼠抗人CD8-FITC（No．11-0086）和鼠抗人CD4-FITC（No．11-0049）購自美國eBioscience公司；尼龍毛購自德國Kisker公司；聚羥基脂肪酸酯購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫組織化學染色 4μm石蠟切片脫蠟至梯度乙醇后，經3%H2O2孵育10 min及枸櫞酸鈉緩沖液（p H 6．0）進行抗原修復后，滴加PD-L2抗體（1∶150）并于4℃冰箱過夜；加二抗后37℃溫箱孵育30 min，以上各步后均用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，最后經DAB顯色并用中性樹脂封片。實驗中用PBS替代一抗作為陰性對照。PD-L2在細胞膜或胞質著色為陽性（＋～＋＋＋），其中染色細胞數10%～25%，染成淡棕色為＋、＋＋；染色細數胞大于25%，染成棕褐色＋＋＋；否則為陰性（-）。

1．3．2 外周血T細胞的分離活化與培養 宮頸鱗狀細胞癌患者的新鮮抗凝外周血經梯度離心后吸取單個核細胞，再經尼龍毛獲得T淋巴細胞。將T淋巴細胞分為對照組、重組PDL2組和PD-L2＋抗PD-1組。在24孔板內將5×105mL-1T淋巴細胞置于RPMI1640培養液（含10%胎牛血清10 mg／L）中37℃、5%CO2孵箱內培養24 h后，3組分別加入PBS、重組人PD-L2蛋白（1μg／mL）和抗人PD-1抗體（2μg／mL）培養48 h進行后續實驗。每組實驗分別重復3次。

1．3．3 流式細胞術檢測T細胞凋亡率 收集上述各組T淋巴細胞，1×106個T細胞懸浮于100μL磷酸鹽緩沖液（PBS）后分別與鼠抗人CD8-FITC、鼠抗人CD4-FITC和Annexin VPE室溫避光孵育30 min，再加入7 AAD避光孵育5 min，PBS洗3次后立即用400μL PBS重懸細胞并進行流式細胞檢測。

1．4 統計學處理 采用SPSS17．0統計軟件進行分析，偏態分布資料采用Fisher精確概率檢驗法，等級資料采用秩和檢驗法。臨床病理特征與PD-L2表達的關系的分析采用Logistic回歸分析。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 PD-L2在人正常宮頸上皮、CINⅡ、Ⅲ級和宮頸鱗狀細胞癌的表達 PD-L2在部分正常宮頸鱗狀上皮的基底層細胞微弱表達，陽性率為20．0%（6／30）；在部分CINⅡ、Ⅲ級細胞中微弱表達，陽性率為20．0%（6／30）；但在子宮頸鱗狀細胞癌的陽性表達率為53．3%（32／60），顯著高于CINⅡ、Ⅲ級的表達率（P＜0．05），見圖1、表1。此外，PD-L2蛋白也在宮頸鱗狀細胞癌局部的間質細胞表達。

2．2 PD-L2表達與臨床病理特征的相關性分析 本實驗對宮頸鱗狀細胞癌PD-L2的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、局部脈管內瘤栓形成以及患者臨床分期和年齡進行相關性分析，結果顯示PD-L2的表達與癌細胞的淋巴結轉移相關（P＝0．023）。進一步進行Logistic回歸分析顯示，PD-L2表達與癌細胞的淋巴結轉移密切相關。在2例發生淋巴結轉移的宮頸鱗狀細胞癌病例中，轉移灶和原發灶癌細胞均表達PD-L2；另2例原發灶癌細胞不表達PD-L2，但轉移灶內癌細胞強陽性表達PD-L2。實驗中還發現同一病例中PD-L2在淺表浸潤的癌細胞中表達略弱于深部浸潤的癌細胞，但統計學結果未能證實PD-L2表達與腫瘤浸潤深度的相關性，見表2。

圖1 PD-L2在不同組織的表達

表1 PD-L2在宮頸鱗狀細胞癌和CINⅡ、Ⅲ組的表達（n）

表2 宮頸鱗狀細胞癌表達PD-L2與臨床 病理特征的相關性［n（%）］

續表2 宮頸鱗狀細胞癌表達PD-L2與臨床 病理特征的相關性［n（%）］

2．3 PD-L2蛋白對患者外周血T細胞凋亡的影響 重組人PD-L2與宮頸鱗狀細胞癌患者外周血T細胞混合培養72 h后，流式細胞術檢測結果顯示PD-L2組T淋巴細胞總凋亡率為26．0%，其中CD8＋T和CD4＋T細胞凋亡率分別為22．4%和17．0%；對照組T淋巴細胞總凋亡率為20．2%，其中CD8＋T和CD4＋T淋巴細胞凋亡率分別為16．2%和9．0%；PD-L2組T細胞、CD8＋T和CD4＋T淋巴細胞凋亡率均明顯高于空白對照組。然而在加入抗PD-1阻斷PD-L2與T淋巴細胞的PD-1結合后，PD-L2＋抗PD-1組T細胞、CD8＋T和CD4＋T淋巴細胞凋亡率均明顯下降，分別為21．8%、17．5%和11．1%，見圖2、3。

圖2 混合培養T細胞的凋亡率

圖3 T淋巴細胞凋亡率

3 討 論

本實驗結果表明，宮頸鱗狀細胞癌異常表達PD-L2，其陽性表達率為53．3%，顯著高于CINⅡ、Ⅲ級細胞及正常宮頸鱗狀上皮細胞，也高于文獻報道宮頸癌細胞表達PD-L2為29．0%的陽性率，原因可能和國外患者與本實驗患者之間存在種族差異以及組織芯片取材范圍局限有關。本研究還觀察到宮頸癌部分間質細胞異常表達PD-L2，結合前期研究發現宮頸癌局部浸潤的淋巴細胞表達PD-L2受體PD-1，以及文獻報道活化T淋巴細胞表達PD-L2與抑制T細胞增殖和分泌細胞因子有關［7］，推測宮頸鱗狀細胞癌細胞及間質細胞表達PD-L2蛋白可能與浸潤淋巴細胞表達的PD-1受體結合，從而發揮對宮頸癌患者微環境的免疫負調節作用。

PD-L2與T細胞的PD-1受體特異結合而負性調節T細胞免疫［8-9］。作者在前期實驗中觀察到人外周血活化T淋巴細胞和宮頸癌組織內浸潤的淋巴細胞大部分表達PD-1，而且宮頸癌微環境內浸潤的淋巴細胞存在凋亡的現象［10］。文獻報道PD-L2既可通過PD-l胞漿區C端的免疫受體酪氨酸抑制基序下調PI3 K／Akt激酶活性，抑制T細胞增殖相關基因的轉錄并促進T細胞凋亡［11］；也可招募酪氨酸磷酸酶-1和酪氨酸磷酸酶-2，使相應的信號分子去磷酸化，從而抑制T細胞增殖活化并使其喪失免疫功能［12］。有研究發現，酪氨酸磷酸酶-1可使T細胞的ZAP70蛋白去磷酸化而抑制其增殖活化，還使p56lck失活而抑制腫瘤內浸潤T細胞的溶瘤作用［13］。本研究將重組人PD-L2與宮頸鱗狀細胞癌患者外周血T細胞混合培養后，觀察到PD-L2蛋白促進外周血T細胞，CD8＋T和CD4＋T細胞凋亡，而且其促進CD8＋T細胞凋亡的作用強于CD4＋T細胞；當采用抗PD-1抗體阻礙T細胞PD-1受體與PD-L2結合后，T細胞、CD8＋T和CD4＋T細胞亞群的凋亡率均下降，提示PD-L2／PD-1途徑促進了宮頸鱗狀細胞癌微環境內T細胞凋亡，從而抑制其抗腫瘤免疫。近期報道不論采用抗體阻斷PD-L2或PD-1，或用RNA干擾技術敲除PD-L2基因均能促進CD8＋T細胞增殖和發揮細胞毒功能［14］；阻斷PD-1使小鼠腫瘤局部浸潤的CD8＋T和CD4＋T細胞數量增多，干擾素-γ水平增高并抑制了鱗狀細胞癌的進展。

綜上所述，本實驗發現宮頸鱗狀細胞癌PD-L2的異常表達與腫瘤微環境T細胞凋亡、抗腫瘤免疫受抑制，從而促進腫瘤的淋巴結轉移相關。因此，PD-1／PD-L2途徑可能成為宮頸鱗狀細胞癌免疫治療的靶點之一。

［1］Rozali EN，Hato SV，Robinson BW，et al．Programmeddeath ligand 2 in cancer-induced immune suppression［J］．Clin Dev Immunol，2012，2012：656340．

［2］Zhang E，Zhang X，Liu J，et al．The expression of PD-1ligands and their involvement in regulation of Tcell functions in acute and chronic woodchuck hepatitis virus infection［J］．PLoS One，2011，6（10）：e26196．

［3］Okazaki T，Honjo T．PD-1 and PD-1 ligands：from discoveryto clinical application［J］．Int Immunol，2007，19（7）：813-824．

［4］Karim R，Jordanova ES，Piersma SJ，et al．Tumor-Expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1＋T-Cellinfiltration and survival of patients with cervical carcinoma［J］．Clin Cancer Res，2009，15（20）：6341-6347．

［5］Rozali EN，Hato SV，Robinson BW， et al．Programmed death ligand 2 in cancer-induced immune suppression［J］．Clin Dev Immunol，2012，2012：656340．

［6］Hamanishi J，Mandai M，Iwasaki M，et al．Programmedcell death 1 ligand 1 and tumor infiltrating CD8＋T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（9）：3360-3365．

［7］Messal N，Serriari NE，Pastor S，et al．PD-L2 is expressedon activated human Tcells and regulates their function［J］．Mol Immunol，2011，48（15／16）：2214-2219．

［8］Blank C，Mackensen A．Contribution of the PD-L1／PD-1pathway to T-cell exhaustion：an update on implicationsfor chronic infections and tumor evasion［J］．Cancer Immunol Immunother，2007，56（5）：739-745．

［9］Butte MJ，Keir ME et a1．Programmed death-1 ligand 1interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit Tcell responses［J］．Immunity，2007，27（1）：111-122．

［10］王渝琦，徐光旭，耿衛樸，等．人子宮頸癌PD-L1的表達及其與腫瘤內浸潤T細胞的相關性研究［J］．第三軍醫大學學報，2010，32（11）：1173-1175．

［11］Parry RV，Chemnitz JM，Frauwirth KA，et al．CTLA-4and PD-1 Receptors Inhibit T-Cell Activation by DistinctMechanisms［J］．Mol Cell Biol，2005，25（21）：9543-9553．

［12］Wang SF，Fouquet S，Chapon M，et al．Early T cell signalling is reversibly altered in PD-1＋T lymphocytes infiltrating human tumors［J］．PLoS One，2011，6（3）：e17621．

［13］Riley JL．PD-1 signaling in primary T cells［J］．ImmunolRev，2009，229（1）：114-125．

［14］Breton G，Yassine-Diab B，Cohn L，et al．siRNA knockdown of PD-L1 and PD-L2 in monocyte-derived dendriticcells only modestly improves proliferative responses toGag by CD8（＋）T cells from HIV-1-infected individuals［J］．J Clin Immunol，2009，29（5）：637-645．