轉錄因子Bli mp1在結核病患者外周血單個核細胞中的表達研究＊

章明徐，陳婉燕，謝小紅，張?？担畎l科，陳 鳴，鄧少麗

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所檢驗科，重慶400042）

結核病的控制一直以來備受關注，全世界每年新增結核病例1 000萬左右，而在我國每年新增病例100萬左右，是我國重點控制的重大疾病之一。傳統觀念認為在結核免疫機制中發揮主要作用的是細胞免疫［1］，近年來，體液免疫在結核發病機制中的作用越來越受到關注。目前已發現的調控體液免疫過程的轉錄因子主要有BCL6、Bli mp1、IRF4、MITF、MTA3、PAX5和XBP-1等，其中Bli mp1是1991年發現的由pr d m1基因編碼的蛋白，是漿細胞分化的主調控子［2-3］。有研究表明，Blimp1不僅可以調控B細胞和漿細胞的分化發育，還可參與調控免疫系統中髓系細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的發育與功能。近期研究發現，Bli mp1對T細胞的增殖分化和免疫自穩亦發揮著至關重要的作用［4-6］。那么，在機體的抗結核免疫反應中，Bli mp1是否會參與其中？本研究擬通過分析結核病患者與健康體檢者外周血單個核細胞中Blimp1 mRNA的表達情況，探討Blimp1是否參與到機體抗結核免疫反應過程中，為進一步探明結核發病機制、結核桿菌免疫清除及結核病診斷新分子提供實驗依據，現報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2012年2月至2013年5月來本院就診的結核患者110例，根據病史、實驗室檢查將其分為活動期組（60例）和潛伏期組（50例）?；顒悠诮M男34例，女26例，年齡13～65歲，平均（34．0±5．6）歲；潛伏期組男31例，女19例，年齡13～65歲，平均（34．0±6．4）歲。上述患者診斷均符合中華醫學會結核病分會制定的肺結核診斷和治療指南中的診斷標準［7］。同時排除肝、腎功能障礙患者，全身免疫性疾病患者，應用糖皮質激素類藥物或免疫抑制劑患者。選擇同期到本院的50例健康體檢者為對照組，排除吸煙、酗酒者，結核菌素試驗均為陰性，其中男23例，女27例，年齡16～78歲，平均（35．0±6．8）歲。

1．2 主要試劑與儀器 Ficoll細胞分離液購自GE公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京中衫公司，Trizol購自Invitrogen公司，焦碳酸乙二酯原液購自Sig ma試劑公司，無核酸酶雙蒸水購自美國Pro mega公司，75%乙醇、異丙醇和氯仿購自重慶川東公司。熒光定量PCR試劑盒、Taq聚合酶購自美國Promega公司，PCR MIX混合液購自杭州博日科技有限公司，引物和探針在上海生工生物工程有限公司合成。美國CFX-96 Bio-Rad熒光定量PCR儀，美國ND-1000紫外分光光度計。

1．3 方法

1．3．1 分離外周血單個核細胞與提取總RNA 抽取結核病患者及健康體檢者的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝靜脈血2 mL，取EDTA抗凝血1 mL，加至1 mL Ficoll細胞分離液表面，常溫下2 000 r／min離心20 min，用毛細吸管將標本中的單個核細胞分離出來，收集并用1%PBS洗滌，常溫下2 500 r／min離心10 min，去上清液留單個核細胞于管底。然后使用Trizol將細胞破裂，利用三氯甲烷、異丙醇和75%乙醇萃取、沉淀的原理，提取出細胞中的RNA。再將RNA溶解在無核酸酶水中，利用ND-1000紫外分光光度計定量檢測RNA的質量和水平。

1．3．2 將RNA逆轉錄為c DNA 根據熒光定量PCR試劑盒說明書取1 mg的RNA進行逆轉錄，42℃孵育40 min得到c DNA，-20℃凍存備用。

1．3．3 熒光定量PCR檢測 對上述逆轉錄后得到的c DNA進行熒光定量PCR反應，引物設計如下：Bli mp1上游5′-TCC AGC ACT GTG AGG TTT CA-3′，Blimp1下游5′-TCA AAC TCA GCC TCT GTC CA-3′。熒光探針，Blimp1 FAM-5′-ATG GAC ATG GAG GAT GCG GAT ATG-3′。內參：B2M上游5′-TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C-3′，B2M下游5′-ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G-3′，B2M探針FA M-5′-TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA-3′。熒光定量PCR反應條件：95℃3 min；95℃10 s，55℃30 s，40個循環。根據熒光定量PCR儀得出的結果，計算活動期組、潛伏期組和對照組中每例標本的靶基因Bli mp1和相應內參基因B2M的ct值差值△ct，并計算活動期組、潛伏期組的和對照組，利用相對定量2-△△ct法（-△△ct＝活動期組／潛伏期組-對照組）計算活動期組、潛伏期組和對照組之間Bli mp1 mRNA表達的差異。

1．4 統計學處理 利用Graphpad Pris m軟件將對照組、活動期組及潛伏期組的ct值和△ct值繪圖分析。采用SPSS17．0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗進行兩組間差異比較，以P＜0．05為差異有統計學意義。t檢驗以△ct均值計算△△ct，并利用相對定量2-△△ct法計算Bli mp1基因表達差異倍數。

2 結 果

2．1 外周血單個核細胞RNA質量及擴增特異性 所有樣本提取總RNA水平均不小于300 ng／μL，吸樂度260／280均在1．75～1．95，提示總RNA質量較好。靶基因Bli mp1和內參基因B2M mRNA擴增曲線見圖1，溶解曲線見圖2。

圖1 熒光定量PCR擴增曲線

2．2 Blimp1 mRNA在3組中表達的差異 活動期組、潛伏期組和對照組Bli mp1和B2M基因的△ct值均呈正態分布?；顒悠诮MBli mp1相對于B2M的平均△ct值為5．36±2．45，潛伏期組相對于B2M的平均△ct值為2．40±1．86，對照組Bli mp1相對于B2M的平均△ct值為1．44±0．80，活動期組、潛伏期組與對照組之間平均△ct值的差異有統計學意義（P＝0．000），見表1。通過相對定量2-△△ct法計算，活動期組的Bli mp1 mRNA水平是對照組的15．35倍，潛伏期組的Bli mp1 mRNA水平是對照組的2．21倍，且組間Blimp1 mRNA表達比較，差異有統計學意義（P＜0．05）。

圖2 溶解曲線

表1 各組間Bli mp1 mRNA相對定量表達差異

3 討 論

機體對結核桿菌的免疫反應相當復雜，大體上可分為固有免疫和適應性免疫。固有免疫主要包括被激活的巨噬細胞和致敏的T淋巴細胞；適應性免疫主要依賴于特異性的細胞免疫，包括抗原呈遞與T細胞的識別、活化、應答幾個階段。雖然細胞免疫在結核免疫反應中發揮著重要作用，但近年來體液免疫在結核病發病機制中的作用也引起了一定關注，研究提示細胞免疫與體液免疫在結核病發展過程中的作用是相輔相成、缺一不可的［1-2］。

調控體液免疫過程的轉錄因子Blimp1可以靶向結合多種基因，通過招募包括組蛋白去乙?；负图谆D移酶在內的染色體修飾酶到特定核酸序列如啟動子序列，來抑制靶基因的表達，起著轉錄抑制因子的作用［7-8］。Bli mp1蛋白是促進成熟B淋巴細胞向漿細胞終末分化的主調控因子［9］，它可抑制與B淋巴細胞增殖有關的一系列基因的表達，如BCL6、PAX5、CMYC、CⅡTA、Id等，促進B淋巴細胞向漿細胞分化。Bli mp1蛋白還可以誘導成熟漿細胞分泌抗體，是維持骨髓中長壽命漿細胞所必需的轉錄因子。Bli mp1功能不僅局限于B細胞和漿細胞，還可參與調控免疫系統中髓系細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的發育與功能。此外，Blimp1對T細胞的增殖分化和免疫自穩亦發揮著至關重要的作用，Bli mp1在Th2細胞中表達高于Th1細胞，而且缺乏Bli mp1的CD4＋T細胞將表現出受損的Th2體液反應效應，說明Bli mp1對Th2細胞的分化及功能的必要性。而且，在Blimp1缺失的兩個動物模型中，也發現受抗原刺激后CD4＋T細胞和Th1細胞均表現出更強的抗凋亡能力［10-11］，說明Bli mp1的正常功能之一就是促進效應T細胞的凋亡。

那么，在結核發病及機體抗結核免疫反應過程中，Bli mp1是否會參與其中？本研究發現，在活動期組血液中Blimp1 mRNA的表達水平為對照組的15．35倍，是潛伏期組結核患者的2．21倍，初步說明Bli mp1參與到機體抗結核的免疫反應中。Bli mp1有可能作為診斷結核的新指標，作為診療結核的新靶點。Bli mp1在機體抗結核免疫反應的具體機制還有待于進一步深入研究。

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