西藏豬模型對(duì)新型生物人工肝治療安全性的評(píng)估＊

熊龍輝，何國林，張 志，汪 艷，潘明新，高 毅

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣州510282）

物理性人工肝對(duì)肝衰竭的臨床治療有一定的支持效果，但生物型人工肝的療效評(píng)價(jià)需進(jìn)一步研究［1］。生物人工肝對(duì)肝衰竭模型治療效果的評(píng)價(jià)是一項(xiàng)復(fù)雜的工程，涉及動(dòng)物肝衰竭模型的建立、生物反應(yīng)器中肝細(xì)胞的大量培養(yǎng)、治療過程中治療模式及參數(shù)的選擇、生命體征的監(jiān)護(hù)、治療前后血液指標(biāo)變化、并發(fā)癥的防治等。若上述任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。故本研究利用西藏豬模型評(píng)估新型生物人工肝治療的安全性，希望能夠?qū)ι锶斯じ未髣?dòng)物體外循環(huán)、腎臟透析、肝衰竭模型的療效評(píng)價(jià)及遠(yuǎn)期臨床應(yīng)用提供一定的經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1．1 材料 6只40～50 kg雌性西藏豬，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：SCXK粵2011-0015）。所需材料包括新一代組合型肝腎支持系統(tǒng)（由南方醫(yī)科大學(xué)和中國科學(xué)院電工研究所共同研制）、人工肝血液管路（自行設(shè)計(jì)）、膜型血漿分離器（日本旭化成可樂麗醫(yī)療株式會(huì)社）、一次性血液灌流器（HA330-Ⅱ）、一次性血液透析雙腔導(dǎo)管、一次性7F雙腔中心靜脈導(dǎo)管、有創(chuàng)血壓心電監(jiān)護(hù)儀、鹽酸氯胺酮注射液、丙泊酚注射乳劑。

1．2 方法

1．2．1 生物人工肝實(shí)驗(yàn)豬模型制備 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。氯胺酮肌肉注射誘導(dǎo)麻醉結(jié)合股靜脈持續(xù)泵入丙泊酚維持麻醉，術(shù)中間斷追加咪達(dá)唑侖鎮(zhèn)靜，待麻醉滿意后，常規(guī)消毒鋪單，并心電監(jiān)護(hù)，觀察實(shí)驗(yàn)過程中心電圖、心率、呼吸頻率、血氧飽和度。分別于股動(dòng)脈及頸內(nèi)靜脈置管以備實(shí)驗(yàn)用。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)豬肝腎支持系統(tǒng)上機(jī) 實(shí)驗(yàn)豬上機(jī)前所有管路以及濾器先用肝素鹽水循環(huán)20 min，再用706代血漿預(yù)充管路，給予靜脈注射地塞米松5 mg，肌肉注射鹽酸異丙嗪注射液25 mg，經(jīng)雙腔管按0．5 mg／kg給予首劑肝素，啟動(dòng)肝素泵，按0．05 mg·kg-1·h-1追加肝素，每小時(shí)監(jiān)測(cè)活化部分凝血酶時(shí)間（APTT），根據(jù)APTT值調(diào)整肝素泵的速率，治療結(jié)束前1 h停止追加肝素。血泵流量調(diào)節(jié)為50～60 mL／min，分漿泵流量調(diào)節(jié)為15 mL／min，倒向泵（LDP）1、LDP2流量調(diào)節(jié)為18 mL／min，反應(yīng)器往返周期為0．4 min。連接壓力監(jiān)測(cè)器檢查各個(gè)報(bào)警裝置。每頭實(shí)驗(yàn)豬接受總共8 h的治療，前2 h模擬混合模式（血液吸附灌流聯(lián)合生物人工肝治療），后6 h模擬單純生物治療模式（撤掉灌流器），每隔1 h記錄1次靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)豬的動(dòng)脈血壓、血氧飽和度、心率、呼吸、心電圖。治療過程中，每隔2 h輸入0．9%生理鹽水200 mL進(jìn)行沖管，以防止堵塞濾器和管路，密切注意豬的胸廓起伏、生命體征的變化。治療結(jié)束后，繼續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)豬飲食、飲水、生命體征變化。同時(shí)從實(shí)驗(yàn)開始及實(shí)驗(yàn)4、8 h股靜脈采血行血培養(yǎng)、內(nèi)毒素測(cè)定，具體由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)科執(zhí)行。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，樣本均數(shù)間比較采用單向方差分析，系統(tǒng)穩(wěn)定性采用質(zhì)量控制圖進(jìn)行分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 一般狀況 6只豬在實(shí)驗(yàn)過程中及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均存活良好。實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)低血壓、高血壓、抽搐、透析綜合征、發(fā)熱、出血等不良反應(yīng)。治療7 d后未見發(fā)熱、切口感染、出血等并發(fā)癥。生物人工肝機(jī)器運(yùn)行過程中無故障，無管路爆破、漏血，血漿分離器未見破膜等情況，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)及實(shí)驗(yàn)4、8 h抽血所測(cè)得的內(nèi)毒素結(jié)果均小于0．5 EU／mL，血培養(yǎng)結(jié)果顯示培養(yǎng)15 d未見細(xì)菌生長(zhǎng)。混合模式治療實(shí)驗(yàn)圖見圖1。

2．2 實(shí)驗(yàn)過程中生命體征變化 西藏豬在實(shí)驗(yàn)過程中心電圖無明顯異常，各時(shí)間點(diǎn)平均動(dòng)脈壓、呼吸頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），實(shí)驗(yàn)2 h心率與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），實(shí)驗(yàn)2 h心率的均數(shù)落在質(zhì)控圖下限外，血氧飽和度、呼吸頻率、平均動(dòng)脈壓樣本均數(shù)各時(shí)間點(diǎn)均在控制線內(nèi)，均能維持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)5 h出現(xiàn)心率加快，血氧飽和度降低，平均動(dòng)脈壓下降的情況。見表1。

表1 西藏豬實(shí)驗(yàn)過程中各時(shí)間點(diǎn)生命體征變化（±s）

表1 西藏豬實(shí)驗(yàn)過程中各時(shí)間點(diǎn)生命體征變化（±s）

時(shí)刻 心率（次／分）呼吸頻率（次／分）血氧飽和度（%）平均動(dòng)脈壓（mm Hg）實(shí)驗(yàn)開始時(shí)84±4 25±13 96±2 105±4 1 h 79±4 21±3 91±16 101±5 2 h 71±9 23±7 94±8 101±9 3 h 80±5 21±5 96±2 99±6 4 h 89±8 25±9 93±7 96±11 5 h 91±7 21±4 90±3 91±7 6 h 77±8 19±2 94±5 99±8 7 h 76±7 20±3 91±2 100±2 8 h 83±10 23±6 92±13 99±6

2．3 生物人工肝支持系統(tǒng)靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓變化 經(jīng)Welch法校正后的入漿壺壓及靜脈壓、跨膜壓均滿足方差齊性。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2．415、2．357、6．163，均P＜0．05），將實(shí)驗(yàn)1～8 h的值與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的值進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓在實(shí)驗(yàn)5 h較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)明顯增高（P＜0．05），而其余各時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表2；除了實(shí)驗(yàn)5 h的均數(shù)點(diǎn)落在控制線以外，其余各點(diǎn)均在控制線內(nèi)。

表2 生物人工肝機(jī)器的壓力值變化（±s，mm Hg）

表2 生物人工肝機(jī)器的壓力值變化（±s，mm Hg）

時(shí)刻 靜脈壓 跨膜壓 入漿壺壓實(shí)驗(yàn)開始時(shí)78．3±4．6 61．2±1．6 46．5±2．2 1 h 78．7±1．5 58．2±5．4 45．5±1．6 2 h 75．3±4．6 62．5±1．7 46．1±3．1 3 h 78．2±5．0 58．2±2．7 44．8±5．3 4 h 79．5±4．7 64．5±2．4 49．0±4．2 5 h 84．4±5．8 68．6±1．8 52．0±3．9 6 h 76．7±4．3 60．7±3．1 46．2±3．9 7 h 81．1±3．5 58．0±5．4 47．0±2．9 8 h 76．1±4．5 58．1±4．9 46．4±2．1

圖1 混合模式治療實(shí)物圖

3 討 論

生物人工肝動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的安全性問題主要涉及細(xì)胞、生物反應(yīng)器、人工肝機(jī)器、動(dòng)物安全性的評(píng)估等方面。目前，國內(nèi)外細(xì)胞安全性問題主要是對(duì)豬逆轉(zhuǎn)錄病毒感染致癌性［2-4］、基因毒性［5-6］、免疫排斥［7］等的研究。生物反應(yīng)器的研究主要圍繞為肝細(xì)胞提供良好的長(zhǎng)期生長(zhǎng)代謝環(huán)境、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)交換，提高肝細(xì)胞活性和功能、反應(yīng)器體積、細(xì)胞數(shù)量等方面的研究［8-10］。然而，關(guān)于生物人工肝機(jī)器和動(dòng)物安全的詳細(xì)報(bào)道甚少。

大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)麻醉成功是實(shí)驗(yàn)得以順利進(jìn)行的前提，氯胺酮復(fù)合丙泊酚麻醉兼?zhèn)滏?zhèn)靜和鎮(zhèn)痛效果，有利于保障呼吸和循環(huán)穩(wěn)定［11-12］。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，沒有行氣管插管，最終能順利完成實(shí)驗(yàn)并且能夠保證動(dòng)物安全。

本研究在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)及實(shí)驗(yàn)4、8 h抽取動(dòng)物體內(nèi)靜脈端的血，所測(cè)得的內(nèi)毒素結(jié)果均小于0．5 EU／mL，符合2004年美國真菌學(xué)研究變態(tài)反應(yīng)學(xué)家協(xié)會(huì)的透析用水及透析液標(biāo)準(zhǔn)［13］。同時(shí)，血培養(yǎng)結(jié)果顯示培養(yǎng)15 d未見細(xì)菌生長(zhǎng)，說明在整個(gè)體外循環(huán)過程中，動(dòng)物血未受到污染，整個(gè)管路、濾器密閉性良好。

實(shí)驗(yàn)中始終要把動(dòng)物的生命安全放在首位，實(shí)驗(yàn)過程中心電圖正常，各時(shí)間點(diǎn)平均動(dòng)脈壓、呼吸頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），實(shí)驗(yàn)2 h心率與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。心率的均數(shù)除了實(shí)驗(yàn)2 h存在散點(diǎn)外，其余各點(diǎn)均在控制線內(nèi)，分析原因可能與丙泊酚的麻醉深度引起的心率下降有關(guān)。由于豬的無創(chuàng)血壓無法監(jiān)測(cè)，本文采取經(jīng)股動(dòng)脈置管接壓力換能器測(cè)定有創(chuàng)血壓，顯示屏可以直接連續(xù)動(dòng)態(tài)顯示收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓，動(dòng)脈血壓能夠反映心臟后負(fù)荷、心肌耗氧和做功及周圍組織與器官血流灌注，是判斷循環(huán)功能的有效指標(biāo)，與心率一起可以初步判定治療過程中有無內(nèi)出血、血容量不足的發(fā)生。平均動(dòng)脈壓、血氧飽和度、呼吸頻率的均數(shù)無散點(diǎn)落在控制線外，而且波動(dòng)不呈規(guī)律性變化，提示系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

在進(jìn)行血液循環(huán)的過程中，人工肝機(jī)器的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)也很重要的，特別是靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓的變化有很大的意義；本實(shí)驗(yàn)中，以上指標(biāo)除了實(shí)驗(yàn)5 h與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其余各時(shí)間與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。而且，除實(shí)驗(yàn)5 h的均數(shù)點(diǎn)落在控制線外（上限外），其余各點(diǎn)均在控制線內(nèi)，而且波動(dòng)不呈規(guī)律性變化，提示系統(tǒng)基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)5 h的血氧飽和度下降、心率加快、平均動(dòng)脈壓下降的情況分析實(shí)驗(yàn)5 h出現(xiàn)壓力值升高的原因是血漿分離器以及管路部分堵塞引起的血紅細(xì)胞數(shù)量減少。堵塞的原因可能與血流量較小、血流緩慢、肝素抗凝不足等有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中每隔2 h用250 mL生理鹽水沖洗管路和濾器，加大肝素用量后恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。另外，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)血泵、分漿泵、倒向泵的速率設(shè)置對(duì)各個(gè)壓力的影響很大。由于血漿分離率最高為30%，分漿過快，血漿分離器達(dá)不到分漿速度，會(huì)導(dǎo)致負(fù)壓破膜，跨膜壓變?yōu)樨?fù)值；若分漿速度設(shè)置過慢，有可能導(dǎo)致滯留在血漿分離器的血過多，導(dǎo)致靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓變大，當(dāng)跨膜壓、靜脈壓增加到一定程度時(shí)，也會(huì)發(fā)生破膜。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的血泵流量為50～60 mL／min，分漿泵流量為15 mL／min，倒向泵LDP1、LDP2流量為18 mL／min，各個(gè)壓力值平穩(wěn)，跨膜壓穩(wěn)定在40～60 mm Hg，保證了有效的分漿率。

因此，在新型生物人工肝系統(tǒng)治療過程中，生命體征處于穩(wěn)定狀態(tài)，血流動(dòng)力學(xué)相對(duì)穩(wěn)定，呼吸以及循環(huán)功能未受到不良影響，人工肝機(jī)器的各個(gè)壓力監(jiān)測(cè)值趨于穩(wěn)定，動(dòng)物的生命安全得以保證，在此基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)豬的肝衰竭模型的有效性。

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