靶向轉化生長因子-βⅡ型受體核酸適配子結合位點預測及相關驗證研究＊

王 薇，黃陽玉，朱曉燕，陳 俠，許 多，肖 奕，謝 琳△

（1．第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所眼科，重慶400042；2．華中科技大學物理學院生物分子物理與模建小組，武漢430074）

抗青光眼濾過手術是治療原發性青光眼的主要方法之一，而濾過術后手術區的濾過通道瘢痕化是手術失敗的主要原因［1］。因此，臨床上常使用5-氟尿嘧啶、絲裂霉素等抗代謝藥物來抑制術后疤痕形成，提高手術成功率，但其無法完全避免諸如濾過泡滲漏、低眼壓、眼內炎、角膜損傷等并發癥的發生。所以，尋求一種更為安全、有效、毒性小的藥物作用于抗青光眼術后抑制瘢痕形成仍然是目前的研究方向。瘢痕的形成與轉化生長因子-β（TGF-β）的活性有著密切關系［2-3］，其中TGF-β與其Ⅱ型受體（TβRⅡ）的結合是導致組織瘢痕化的始動環節。因此，拮抗或者抑制TGF-β與TβRⅡ的結合，可為青光眼濾過術后抗瘢痕提供新的方法。本課題組前期應用指數富集的配基系統進化技術（SELEX）篩選出TβRⅡ的單鏈核酸適配子S58，并驗證了S58可對TGF-β介導的人Tenon囊成纖維細胞（HTFs）分化產生抑制作用［4］。適配子作用藥物從基礎轉向臨床必須在穩定性上進行優化驗證，甚至需要對基團修飾。而核酸適配子能夠識別靶分子并結合緊密是基于其三維結構，單鏈核酸適配子結構靈活多變，能在溶液根據靶分子結構發生適用性折疊重構，形成幾何構象匹配、熱力學穩定的空間結構，比如與靶分子形成口袋、假結等結構［5］。因此，研究適配子S58的三維結構是有必要的，本研究建立S58的三維模型，旨在預測S58與TβRⅡ的結合部位，并進一步驗證S58的高親和力及特異靶向性，從而明確S58的結構穩定性及特異性。

1 材料與方法

1．1 材料 本研究中所用細胞由本課題組前期原代培養的HTFs傳代而來［6］，取第4～10代對數生長期的細胞用于實驗。

1．2 主要試劑及儀器 DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗、Hanks平衡鹽溶液（美國Hyclone公司）；人重組TGF-β2蛋白（美國Peproteeh公司）；鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（美國Abcam公司）；鼠抗人單克隆β-actin抗體、辣根標記山羊抗兔Ig G、辣根標記山羊抗鼠Ig G（北京中杉公司）；TβRⅡ胞外段蛋白（美國Rapidbio公司），核酸適配子S58（5′-ACA TTG CTG CGT GAT CGC CTC ACA TGG GTT TGT CTG GTC GAT TTG GAG GTG GTG GGT GGC-3′）及各剪切序列均由上海生工生物工程公司進行DNA合成。生物傳感器（美國Ther mo公司）；蛋白電泳及轉膜設備（美國Bio-Rad公司）；光學倒置相差顯微鏡（日本Oly mpas公司）。

1．3 方法

1．3．1 三維建模 目前沒有直接的軟件可用于預測單鏈DNA的三級結構，本研究采用3d RNA［7］先建立RNA的三級結構，3d RNA是一個基于RNA序列和二級結構的預測方法，再通過計算機測算翻譯突變為DNA的三級結構。首先應用DNA序列轉錄成RNA序列，應用mfold［8］軟件進行RNA的二級結構預測，再通過輸入RNA序列和二級結構，3d RNA可以預測RNA的三級結構。得到RNA的三級結構之后，需要將其轉化成對應的DNA結構。這個過程分為兩步：（1）核苷酸突變；（2）優化結構。首先，對于RNA結構中的每一個核糖核苷酸分子，用對應的脫氧核糖核苷酸分子進行取代，即進行重疊操作，重疊的原子只包括堿基。通過上述的重疊操作，得到的DNA分子可能有部分共價鍵斷裂或者原子重疊，所以需要進行結構的優化［9］，本研究采用amber對其進行了優化。TβRⅡ胞外段蛋白可以直接通過蛋白質數據庫搜索得到晶體結構。

1．3．2 分子對接預測結合位點 得到2個分子的三維結構后采用Hex Server程序［10］對2個分子進行對接。Hex Server是一個基于圖像處理的進行蛋白質與蛋白質、DNA、RNA的對接服務器。Hex Server經過運行測算給出最有可能對接后的20個相互作用能量最低的復合物構象。在此基礎上使用軟件Bind N［11］預測受體蛋白可能的結合位點，Bind N是一個基于網絡的根據氨基酸序列來有效預測蛋白質的DNA、RNA結合位點工具。其預測DNA的結合殘基靈敏度為69．40%，特異度為70．47%，根據支持向量機大于0．372 5預測出24個與DNA的結合殘基位點，這樣又進一步縮小了結合位點的范圍。最后進一步采用分子動力學模擬方法進行進一步細致的分子對接。

1．3．3 適配子ss DNA與TβRⅡ的親和力檢測 采用第三軍醫大學附屬西南醫院中心實驗室建立的生物傳感器技術檢測S58及各剪切的DNA與TβRⅡ的親和力大小。按照已經建立的方法包被TβRⅡ，S58及剪切的DNA各組均采用杜氏磷酸鹽緩沖液溶解成200 mg／L，取5μL上樣，檢測與TβRⅡ的親和力［12］。

1．3．4 蛋白免疫印跡法（Wester n blot）法檢測人HTFs中α-SMA的表達 培養8瓶HTFs待貼壁并長至70%左右融合，將培養基換為無血清培養基再培養24 h，分別加以DMEM（DMEM對照 組）、TGF-β2、TGF-β2＋S58、TGF-β2＋S58（3′-5 bp）、TGF-β2＋S58（3′-10 bp）、TGF-β2＋S58（5′-5 bp）、TGF-β2＋S58（5′-10 bp）、TGF-β2＋S58（5′-15 bp）誘導HTFs 24 h，并以此分為不同的組別。各組TGF-β2濃度均為2 ng／mL，DNA濃度均為50 n mol／L；中止刺激后PBS清洗細胞3次，每次10 min，每瓶加入180μL含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍G-2250法測定每個樣本中的蛋白濃度。根據蛋白濃度取30μL樣品上樣，質量分數10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳。蛋白質轉膜180 min。質量分數5%脫脂牛奶室溫封閉膜2 h。鼠抗人α-SMA單克隆抗體按1∶200比例加入到2 mL 5%脫脂牛奶中4℃孵育膜過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，辣根標記山羊抗鼠Ig G按1∶5 000比例加入到2 mL 5%脫脂牛奶中室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。發光液作用于膜上，暗室內曝光，觀察X線片上的條帶，掃描后保存，Quantity One 4．6．2軟件（美國Bio Rad公司）計算出膠片上各蛋白條帶灰度值，計算出α-SMA相對表達量，并作出柱狀圖。

1．4 統計學處理 采用SPSS13．0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 適配子ss DNA S58及TβRⅡ胞外段的三維模型 RNA預測為一個帶發卡結構的RNA，轉換成單鏈DNA時，DNA自身適應性互補形成局部雙螺旋結構。蛋白質數據庫中搜索得到TRβⅡ胞外段蛋白1PLO，由122個氨基酸組成，有10種自然態結構，并且是以二聚體結構存在。比對TGF-β與其受體的復合晶體結構，找到10種自然態中最接近與配體結合時的結合態結構1PLO-3，其結構緊密，包括了9個β折疊。見圖1。

圖1 適配子ss DNA S58（左）及TβRⅡ胞外段（右）的三維結構

2．2 適配子ss DNA S58及TβRⅡ胞外段蛋白的分子對接 人為去掉DNA 3′端游離的5個堿基及受體蛋白兩端游離氨基酸部位，將優化后的S58結構與TβRⅡ胞外段蛋白進行分子對接，得到10個相互作用能量最低的對接構象，相互作用能量包括2個分子之間的靜電力和范德華力，可以間接反映適配子DNA與TβRⅡ胞外段蛋白的結合情況，相互作用的能量越低，結合則越穩定。因此選擇最低能量-502．65 kJ／mol的對接構象，見圖2。對接位置位于DNA的中間部位，運用Cocomaps軟件分析，使用8?作為定義結合殘基的距離閾值，即對于復合物中核酸的某個氨基酸殘基，如果其包含的至少一個原子與復合物中核酸序列的任何一個原子間的距離小于8?，那么這個氨基酸殘基為核苷酸-結合殘基。相對應的核酸結合位點分別包括位點Ⅰ（T4、T5、G6、C7）、位點Ⅱ（G13、A14、T15、C16、G17、C18）、位點Ⅲ（T31、G32、T33、C34）及位點Ⅳ（G40、A41、T42、T43、T44、G45、G46）。

圖2 適配子ss DNA S58與TβRⅡ胞外段對接位點

2．3 剪切S58與親和力檢測 根據S58與TβRⅡ胞外段的結合位于DNA中間部位，采取分別從DNA兩端逐步剪切堿基，每次剪切5 bp。S58與TβRⅡ胞外段的結合力最強，其次為S58-5即3′端剪切5 bp，但不論從5′端還是3′端開始剪切DNA S58，得到的結構修飾后DNA親和力與S58相比均沒有明顯增加，反而有所下降。見圖3。

圖3 S58-1～7與TβRⅡ胞外段的結合力檢測

2．4 結構優化后DNA作用下細胞α-SMA的表達變化 α-SMA是肌成纖維細胞的標志性蛋白，是瘢痕收縮的物質基礎。TGF-β2組刺激HTFs后α-SMA表達較DMEM對照組明顯增加（P＜0．001），TGF-β2＋S58組刺激HTFs后α-SMA表達較TGF-β2組明顯降低（P＜0．001），所有結構優化后的DNA中只有TGF-β2＋S58（3′-5 bp）組較TGF-β2組α-SMA表達有明顯降低（P＜0．001），但其降低程度不如TGF-β2＋S58組，其他組與TGF-β2組比較α-SMA表達差異均無統計學意義（P＞0．05），見圖4。

圖4 各實驗組刺激下HTFs表達α-SMA的變化

3 討 論

適配子在眼科方面已經有很大進展，目前許多研究顯示適配子如貝伐單抗、寡聚核RNA-寡聚苷酸、培加尼布等能通過抑制血管內皮生長因子作用從而明顯降低眼部的血管形成。哌加他尼鈉是第一個通過美國食品與藥品管理局認證用于治療年齡相關性黃斑變性的核酸適配子藥物［13］，還有其他治療眼部新生血管的適配子藥物在臨床實驗中。因此，能封阻TβRⅡ降低青光眼術后濾過區纖維化形成的適配子S58成為新的研究切入點。適配子應用于臨床治療的優點在于其親和力高、穩定性好、易人工合成。所有的適配子能發揮高效、特異的作用，基于其特殊的、穩定的三維結構，與靶分子特異的作用位點結合，且具有較高的親和力［14］，所以，研究適配子與靶分子的結合位點及結合力是解釋適配子發揮生物效應的理論根據，并且進一步驗證適配子的穩定性可為適配子運用于臨床藥物提供理論依據。

隨著計算機技術的飛速發展，計算機技術輔助研究蛋白質和核酸的相互作用成為當下的熱點，特別是在藥物分子的篩選和設計方面已經有很大進展［15］。其中分子對接是針對研究配體與受體分子之間的相互作用，基于結合的復合物構象，預測其結合模式與親和力的一種重要理論方法。Luscombe等［16］利用氨基酸序列的保守性構建計算機算法來預測蛋白質／DNA復合體中DNA的結合位點。研究2個分子的結合位點，首先需要建立2個分子的三維結構。寡核苷酸適配子在溶液中可以形成假結、發夾、凸環、G-四分體等三維空間結構，通過氫鍵、范德華力、疏水堆積作用等與靶分子緊密結合。有研究表明，適配子與靶分子的結合是相互誘導的適應性識別，當靶分子存在時，單鏈DNA或RNA發生適應性折疊，與靶分子相互識別［17］。本實驗中適配子S58即為60個堿基的寡核苷酸，與靶受體蛋白作用時遵循“鎖鑰原理”，發生適應性自身堿基互補情況，且DNA帶負電荷，在與靶受體蛋白結合時會向帶正電荷的堿性氨基酸靠近，DNA分子的靈活性使其能夠形成的結構千變萬化，單鏈DNA有局部自互補的情況，由于適配子的結構特殊性，其三維結構預測往往需要從二級結構著手，因此DNA的三維結構預測有一定難度。蛋白質的結構可以通過蛋白質晶體學得到或者從蛋白質數據庫中找到其已知的結構，正如本實驗中的TβRⅡ胞外段蛋白結構。分子對接的結果表明，DNA與TβRⅡ胞外段蛋白的結合位點均在空間結構上與受體相靠近或與受體存在氫鍵相互作用，這些位點在配體與受體結合、定位和水解過程中可能發揮重要作用，實驗從適配子S58的三維建模研究切入，合理地運用大量目前廣泛得到認可成功率較高的建模、分子對接軟件，在理論上較為準確地預測到適配子S58與TβRⅡ胞外段蛋白的結合位點，極大地減少可能的結合位點數量，為進一步實驗提供指導。

生物傳感器是從分子水平檢測生物分子活性力的技術手段，其檢測快速、靈敏度高、選擇性強，近年來在醫學領域應用越來越廣泛，特別是針對核酸與蛋白質的作用檢測，Mccauley等［18］研制了基于蛋白芯片基礎的適體生物傳感器來對蛋白進行分析鑒定，這種傳感器可以固定著針對不同蛋白質的DNA和RNA適體。本實驗也運用生物傳感性針對TβRⅡ胞外段蛋白，根據計算機預測的核酸適配子與TβRⅡ胞外段蛋白的結合位點提示5′端剪切掉5 bp會影響到結合位點Ⅰ（T4、T5、G6、C7），故5′端剪切進一步驗證剪切后DNA S58～4與TβRⅡ胞外段蛋白的親和力是下降的，細胞水平上也對TGF-β2刺激后的HTFs表達α-SMA無明顯抑制作用，這與計算機預測的結果相符。又因為SELEX技術在篩選過程中是必須應用大容量的隨機寡核苷酸文庫，大約在1 010個隨機RNA序列中才有一個序列與靶分子特異結合［18］，且核酸文庫中是由中間為一定長度的隨機序列和5′、3′端的固定序列構成，固定序列是多聚酶鏈式反應及其他酶學反應相關引物的結合位點。因此，推測剪切掉的5′端序列是帶有限制性內切酶位點的固定序列。但當同時選擇剪切3′端序列時，當剪切掉5 bp時，DNA與TβRⅡ胞外段蛋白親和力有所下降，盡管能抑制TGFβ2刺激后HTFsα-SMA的表達，但實驗組α-SMA的表達仍較S58組強，抑制TGF-β2介導的HTFS轉分化作用是較S58減弱的，并且在剪切3′端非預測的結合位點后，適配子與TβRⅡ胞外段蛋白親和力同樣也下降。推測因單鏈核苷酸在不同的溶液、p H、溫度等因素下易形成多種空間構象，特別在剪切掉適配子序列后極有可能改變核苷酸局部的結構，從而無法與靶向TβRⅡ胞外段蛋白質的關鍵作用位點結合。因此，進一步論證了S58為靶向TβRⅡ的特異性分子，結構上具有高度穩定性，任何結構的改變均會降低與TβRⅡ的親和力，為S58的體內實驗提供了明確的理論基礎。

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