靶向抑制滑膜細胞TNF-α表達的siRNA 篩選及鑒定＊

沈孝龍，廖 琦，郝 亮

（南昌大學第二附屬醫院骨科，南昌330006）

創傷性關節炎主要是負重關節創傷后引起的一種后遺癥，即強大暴力使受累關節正常組成部及解剖結構受到破壞，引起軟骨變性、破壞及在此基礎上的關節軟骨、軟骨下骨、滑膜、關節囊、周圍肌肉和韌帶等的一系列改變，最后導致受累關節疼痛、功能障礙［1-2］。近年來的研究表明，細胞因子和生長因子在骨性關節炎發生發展的病理生理過程中起著重要作用，它們與滑膜、關節軟骨和軟骨下骨的功能改變密切相關［3］。一些因子在關節炎的病理過程中對關節軟骨和關節滑膜具有一定的破壞作用，其中最引人注目的是TNF-α，這是關節炎病理過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的最重要的細胞因子之一［4］。研究證實在骨關節炎（OA）患者的關節液中IL-1、TNF等細胞因子水平明顯升高［5］。RNA 干擾技術（RNA interference，RNAi）是簡單、高效阻斷哺乳動物細胞內基因表達的最有效方法。本研究采用RNAi方法，設計并篩選出針對TNF-α基因的小型干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），抑制人滑膜細胞中TNF-α基因的表達，為創傷性關節炎的的基因治療開辟新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 創傷性膝關節炎滑膜細胞；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；實時熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒（日本TOYOBO 公司，QPS201）；逆轉錄試劑盒（美 國Promega 公司）；PRISM?7500Sequence Detection System（美國ABI公司）；Hema9600基因擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；低溫冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Beckman Coul-ter DU?520UV／Vis Spectrophotometer（美國Beckman Coulter公司）；JS-power300電泳儀（上海培清科技有限公司）；培清JS-780全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；潔凈工作臺（蘇州安泰SW-CJ-IFD）；低速離心機（上海安亭，TDL-80-2B）；倒置光學顯微鏡（OPTEC，BDS200）；細胞恒溫培養箱（Thermoscientific，HERACELL150i）；十萬分之一電子天平（丹佛，TP-214）；水平搖床（北京六一，WD-9405B）；培養基（GIBCO）：DMEM-F12；胎牛血清（Hyclone）：20%；青鏈霉素（碧云天）：1%；無蛋白干細胞用凍存液（賽業生物科技），細胞上清液TNF-αELISA 檢測試劑盒（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 的設計與合成 siRNA 由銳博生物 科技有限公司設計、合成序列如下，（1）［siRNA-h-TNF-α＿001］，靶序列：GCG TGG AGC TGA GAG ATA A；正義鏈（5′～3′）：5′-GCG UGG AGC UGA GAG AUA A dTdT-3′；反義鏈（3′～5′）：3′-dTdT CGC ACC UCG ACU CUC UAU U-5′。（2）［siRNA-h-TNF-α＿002］，靶序列：AGA CCA AGG TCA ACC TCC T；正義鏈（5′～3′）：5′-AGA CCA AGG UCA ACC UCC U dTdT-3′；反 義 鏈（3′～5′）：3′-dTdT UCU GGU UCC AGU UGG AGG A-5′。（3）［siRNA-h-TNF-α＿003］，靶 序 列：GAC TCA GCG CTG AGA TCA A；正義鏈（5′～3′）：5′-GAC UCA GCG CUG AGA UCA A dTdT-3′；反義鏈（3′～5′）：3′-dTdT CUG AGU CGC GAC UCU AGU U-5′。

1.2.2 細胞培養 首先使用多聚賴氨酸處理細胞培養瓶培養表面，采用DMEM-F12培養液（含20%胎牛血清和1%青-鏈霉素），37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱孵育，常規用0.25%胰酶消化傳代，用第3～6代處于對數生長期創傷性膝關節炎滑膜細胞進行實驗。

1.2.3 Lipo2000轉染siRNA 轉染前1d將滑膜細胞以1×105個／孔接種至12 孔細胞培養板中。每孔中加入不含抗菌藥物的培養基，待細胞密度達到70%～90%時進行siRNA 轉染，結果分為4組：陰性對照組（NC 組）、TNF-α001組、TNF-α 002組、TNF-α003組，對于每個轉染樣品，按說明書準備siRNA-Lipo2000混合液，將siRNA-Lipo2000 混合液加入含有1 mL培養基的相應培養孔中輕輕混勻，培養4～6h后，將培養孔中含siRNA-Lipo2000混合液的培養基移去，更換新鮮完全培養基。置培養板于37 ℃的CO2培養箱中培養48h。

1.2.4 RT-PCR檢測TNF-αmRNA 表達水平

1.2.4.1 提取細胞總RNA 嚴格按照說明書使用TRizol試劑裂解細胞并提取細胞總RNA。

1.2.4.2 RT-PCR分析 采用美國Promega公司反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，所有操作在冰浴條件下進行，20μL 反應體系徹底混合后，30 ℃孵育10min，42℃孵育60min，72℃孵育10 min，然后進行RT-PCR 反應。RT-PCR 反應引物序列（由上海生工生物合成）如下，Human TNF-α：正義鏈5′-GTC TGG GCA GGT CTA CTT TGG-3′，反 義 鏈5′-GGT TGA GGG TGT CTG AAG GAG-3′；Human 18srRNA：正義鏈5′-GTC TGG GCA GGT CTA CTT TGG-3′，反 義 鏈5′-GCG GCG CAA TAC GAA TGC CCC-3′，冰浴條件下操作，徹底混合后放入：ABI PRISM?7500Sequence Detection System 儀器，使用軟件7500software v2.0.6分析，反應程序如下：95 ℃1 min，95 ℃15s，62 ℃30s（收集熒光信號），40個循環，60 ℃，所有反應設3個復孔反應，結束后確認RT-PCR 的擴增曲線和融解曲線，結果采用相對定量法分析，目的基因相對表達量利用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.5 ELISA 檢測細胞上清液TNF-α 收集上述轉染48h后的細胞上清液，按BD 公司TNF-αELISA 試劑盒說明書嚴格操作。使用試劑盒提供的標準品按說明書稀釋制作標準曲線，每個樣品進行3復孔檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用χ2檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 滑膜細胞形態學觀察 見圖1。

圖1 細胞形態學觀察（×25）

2.2 RT-PCR檢測TNF-αmRNA 表達水平 同等劑量的3對化學合成的TNF-α-siRNA （siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）Lipo-2000轉染人創傷性關節炎滑膜細胞，分別進行熒光定量PCR 檢測。結果顯示，轉染后的TNF-α001、TNF-α002組人創傷性關節炎滑膜細胞TNF-α mRNA 均有明顯抑制作用，TNF-α001組無明顯抑制作用。48h后TNF-α001組、TNF-α 002組、TNF-α003組3組細胞中mRNA 相對表達量分別為1.13±0.28、0.24±0.04 和0.42±0.06，與NC 組的1.00±0.00相比，TNF-α002 組減少76%，TNF-α003 組減少58%，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 轉染不同TNF-α-siRNA 滑膜細胞的TNF-αmRNA 表 達

2.3 ELISA 實驗結果 采用siRNA 轉染后可抑制創傷性關節炎滑膜細胞分泌TNF-α，3組不同siRNA 轉染對TNF-α的抑制效果不同，TNF-α001組無明顯抑制效果，與NC 組比較無統計學差異，TNF-α002組、TNF-α003組抑制較明顯，與NC組比較差異有統計學意義（P＜0.01），第2、3 組抑制效果比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同siRNA 作用后滑膜細胞分泌 TNF-α含量（±s，pg／mL）

表1 不同siRNA 作用后滑膜細胞分泌 TNF-α含量（±s，pg／mL）

-：表示此項無數據。

組別 n TNF-α水平P NC組3 161.47±6.15 -TNF-α001組 3 162.45±7.17 0.998 TNF-α002組 3 91.41±6.81 0.001 TNF-α003組3 93.15±9.63 0.007

3 討 論

關節損傷后，OA 的發生幾乎不可避免［6］。關節液內的炎性因子是造成創傷性關節炎關節損傷的重要因素［7-8］。TNF-α能刺激軟骨細胞和滑膜產生基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶，促進軟骨基質的降解；刺激滑膜產生NO，誘導關節軟骨細胞的凋亡；促進軟骨細胞和滑膜細胞產生前列腺素E2（dinoprostone prostin E，PGE2）參與炎癥反應；促進成骨細胞樣細胞的增殖和骨吸收，參與骨質增生和軟骨下骨囊形變的形成；介導軟骨細胞分化，節軟骨細胞表型變成成纖維細胞表型；抑制蛋白多糖的合成；抑制滑膜細胞的增殖［9］。目前的研究認為，TNF-α不但可以引起軟骨基質的破壞，而且抑制基質的修復，是創傷性關節炎病理進程中促進軟骨破壞和基質降解最重要的細胞因子之一［10］。RNAi是指通過引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA（dsRNA），誘導內源靶基因的mRNA降解，從而特異性的使靶基因轉錄后出現沉默的現象，經過近10年的發展，RNAi技術已較為成熟［11］。目前，利用RNAi阻斷TNF-α表達，進而評價對滑膜細胞的作用效果的報道很少，siRNA 的最有效作用靶點需要進一步研究。

本研究結合上述研究進展，針對TNF-a基因序列重新設計并構建出3組siRNA，特異性抑制滑膜細胞中TNF-α基因的表達，研究中通過RT-PCR 準確計算出了RNA 被干擾后TNF-α的減少程度，與NC 組相比，TNF-α002組、TNF-α003組分別減少76%、58%，差異有統計學意義（P＜0.01）；隨后進一步通過ELISA 觀察細胞上清液TNF-α分泌受抑制，3組不同siRNA 轉染對TNF-α的抑制效果不同，TNF-α001組無明顯抑制效果，以TNF-α002組、TNF-α003組較明顯，與NC組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。充分驗證并成功篩選出2對能夠有效抑制滑膜細胞中TNF-α表達的siRNA（TNF-α-2、TNF-α-3）為進一步研究TNF-α的基因治療奠定基礎。

基因組學研究顯示，數個基因組區間與OA 關系密切，例如TNF-α、IL-1等基因［12］。siRNA 應用于沉默特定基因表達，通過抑制致病因子TNF-α等的基因功能，使針對致病基因的siRNA 用于臨床治療疾病成為可能，將給創傷性關節炎的研究提供新思路。

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