艾司洛爾對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡及心功能的影響

劉德紅，劉映峰，孟新科，徐志偉

（1.南方醫科大學珠江醫院心血管內科，廣州510282；2.廣東省深圳市第二人民醫院急診科 518035）

心臟是膿毒癥早期受損的主要靶器官之一，全身器官衰竭和心功能下降互為因果，隨后誘發的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征（MODS）是臨床醫生所面臨的困境［1］。而此過程的中心環節是心肌細胞凋亡，可以造成患者左室射血分數（LVEF）下降30%左右［2］。無論是在心衰還是在圍術期中的使用，β受體阻滯劑對心臟的保護作用已得到人們的認可，但有關短效β受體阻滯劑艾司洛爾對全身炎性反應中心功能改善的報道甚少。因此，本研究旨在探討艾司洛爾對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡及心功能的保護作用和相關機制，為臨床早期治療膿毒癥，挽救瀕死心肌，延緩病情發展和降低病死率提供實驗依據和新的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取96 只清潔級健康雄性SD 大鼠，體質量（250±20）g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。適應性飼養7d后開始實驗，分為假手術組32只，膿毒癥組32只，治療組32只。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采用盲腸結扎加穿孔法建立大鼠膿毒癥模型［3］。假手術組僅開腹探查盲腸，不行盲腸結扎穿孔。手術完成后，治療組大鼠于尾靜脈持續泵入艾司洛爾1mg·kg-1·min-1至處死，膿毒癥組泵入等量生理鹽水。膿毒癥組和治療組大鼠在建模3h內出現反應變差，活動減少，叫聲減弱，在后期處死后腹腔可聞及惡臭，結扎盲腸呈現深色，腸黏膜充血水腫表示建模成功。3組大鼠建模成功后3、6、12、24h每個時間點各取8只大鼠麻醉開胸，采集主動脈血5mL，促凝后離心分離上清液測心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平；摘取心臟，取心尖部心肌組織分成2份，1份液氮凍存以制備組織勻漿測定caspase-3活性，1份甲醛固定石蠟包埋以測定心肌細胞凋亡指數。3組大鼠在第24h開胸前采用GE VIVID7超聲儀測定左室舒張末內徑（LVEDd）、左室收縮峰壓（LVPP）、短軸縮短率（FS）和LVEF，探頭頻率為5 MHz。

1.2.2 cTnI測定 cTnI測定采用南京基蛋生物科技有限公司提供的cTnI檢測試劑盒，測定方法為干式免疫熒光定量法，所有試驗操作嚴格按照有關說明書進行。

1.2.3 心肌細胞caspase-3活性測定 心肌組織勻漿后離心取上清液50μL，加入1μL 抑制劑和50μL 緩沖液（抑制劑和緩沖劑按照標準操作說明配取），37 ℃水浴1h后再次加入5 μL緩沖液，混勻后加5μL酶作用底物再次水浴1h，以配制的蛋白樣品（1mg／mL）為標準對照管，蒸餾水空白管，采用熒光分光光度儀測定第2次水浴前后的熒光值，使用曲線軟件curveexpert進行分析計算caspase-3活性。

1.2.4 心肌病理標本制作和心肌細胞凋亡指數測定 標本在石蠟包埋固定后切片，常規HE 染色，光學顯微鏡觀察。常規甲醛固定石蠟包埋脫水后，用蛋白酶K 室溫孵育，3%過氧化氫室溫下再次孵育以阻斷過氧化物酶活性，加入TUNEL反應液，滴加轉化劑，沖洗后滴加DAB底物溶液，蘇木素染色后光學顯微鏡下觀察，心肌細胞核發現棕黃色顆粒為凋亡細胞。隨機選取5個400 倍光鏡視野，計算凋亡細胞所占比例，取平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，計數資料用百分比表示。3組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，3組內兩兩比較采用LSD 檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 膿毒癥模型制備結果和病理切片觀察 假手術組各個時間點和膿毒癥建模后3、6h大鼠成活率為100.0%。膿毒癥組和治療組12h成活率分別為87.5%和100.0%，而24h成活率分別為75.0%和87.5%。光鏡下假手術組心肌細胞結構緊密，未見明顯水腫，充血及細胞質滲出；膿毒癥組可見大量壞死心肌細胞，且水腫明顯，細胞核腫脹，心肌纖維斷層改變，細胞間質血管充血擴張（為對比明顯，選用心肌壞死較為明顯的染色圖片進行對比觀察）；治療組心肌細胞水腫較輕，壞死灶不明顯，可見少量心肌纖維斷層改變，見圖1。

2.2 3組大鼠血清cTnI水平和心肌細胞凋亡指數比較 假手術組血清cTnI水平無顯著性變化（P＞0.05）。膿毒癥組和治療組各時間點cTnI水平均較假手術組升高（P＜0.05），其中膿毒癥組在12h達峰值，治療組在6h達峰值，6、12、24h膿毒癥組較治療組cTnI明顯升高（P＜0.05）。假手術組心肌凋亡細胞較少，膿毒癥組和治療組均出現不同程度的細胞凋亡，但治療組凋亡的心肌細胞明顯少于膿毒癥組（圖2）。隨著時間延長，膿毒癥組心肌細胞凋亡指數逐漸升高，治療組只在24 h升高，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。膿毒癥組在4個時間點心肌細胞凋亡指數均高于治療組（P＜0.05），見表1。

2.3 3組大鼠心肌細胞caspase-3活性比較 膿毒癥組和治療組各時間點caspase-3活性均較假手術組升高（P＜0.05）；其中膿毒癥組在12h達峰值，治療組在6h達峰值，且膿毒癥組12h 和24hcaspase-3 活性都較治療組顯著升高（P＜0.05），見表2。

圖1 建模24h心肌細胞HE染色（×200）

表1 不同時相血清cTnI水平（ng／mL）和心肌細胞凋亡指數（%）變化（±s）

表1 不同時相血清cTnI水平（ng／mL）和心肌細胞凋亡指數（%）變化（±s）

＊：P＜0.05，與假手術組比較；＃：P＜0.05，與治療組比較；△P＜0.05，與3h比較。

組別 3h 6h 12h 24h F P假手術組 cTnI 0.40±0.03 0.45±0.04 0.46±0.06 0.42±0.06 2.05 0.071 凋亡指數 1.50±0.35 2.64±0.89 2.87±0.43 2.73±0.31 2.84 0.075膿毒癥組 cTnI 2.48±0.54＊＃ 5.94±0.57＊＃△ 6.96±0.47＊＃△ 3.91±0.58＊＃△ 111.08 ＜0.001 凋亡指數 23.84±5.19＊＃ 42.51±7.24＊＃△ 52.51±8.12＊＃△ 55.48±8.44＊＃△ 74.25 ＜0.001治療組 cTnI 1.98±0.19＊ 3.19±0.84＊△ 3.18±1.01＊△ 1.99±0.45＊ 7.82 0.001 凋亡指數 17.54±3.51＊ 19.54±3.94＊ 20.63±4.33＊ 30.48±4.82＊△ 84.10 ＜0.001

2.4 3組大鼠第24小時心功能比較 膿毒癥組和治療組第24小時LVEF、LVPP和FS均較假手術組下降，LVEDd明顯升高（P＜0.05），治療組LVEF 較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05），而治療組LVPP 與膿毒癥組沒有差異（P＞0.05），見表3。

圖2 心肌細胞TUNEL染色（×400）

表2 不同時相心肌細胞caspase-3活性變化（±s，μm·h-1·mg-1）

表2 不同時相心肌細胞caspase-3活性變化（±s，μm·h-1·mg-1）

＊：P＜0.05，與假手術組比較；＃：P＜0.05，與治療組比較；△：P＜0.05，與3h比較。

組別 3h 6h 12h 24h F P假手術組 7.01±1.81 7.52±2.58 8.01±2.34 6.80±1.56 1.55 ＞0.05膿毒癥組 12.86±3.59＊ 16.91±4.27＊ 20.95±4.57＊＃△ 18.54±7.24＊＃ 109.57 ＜0.001治療組 10.07±3.00＊ 14.27±3.66＊△ 11.27±2.95＊ 8.99±2.28＊ 18.25 ＜0.001 F 4.57 85.84 187.54 145.40 P 0.005 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 第24小時心功能指標的變化（±s）

表3 第24小時心功能指標的變化（±s）

＊：P＜0.05，與假手術組比較；＃：P＜0.05，與治療組比較。

組別 LVEDd（mm） LVEF（%） LVPP（mm Hg） FS（%）假手術組 4.62±0.41 78.81±12.64 137.54±15.27 56.19±4.80膿毒癥組 7.16±0.89＊＃ 50.16±6.84＊＃ 109.24±12.90＊ 21.43±3.18＊＃治療組 6.27±0.57＊ 63.86±7.06＊ 112.51±12.57＊ 39.62±3.94＊F 7.12 9.05 6.14 28.517 P 0.003 0.002 0.007 ＜0.001

3 討 論

腎上腺素能系統在膿毒癥時被高度激活，大量的兒茶酚胺釋放可以引起心肌損害，并損害心功能［4-5］。目前，大鼠盲腸結扎加穿孔法是臨床相關性最強的膿毒癥模型，大鼠在其中表現出的早期高代謝和晚期低動力循環都表明，維持正常的心功能和血流動力學是成功救治膿毒癥的關鍵［6-7］。

徐秋林等［8］研究發現，膿毒癥大鼠不僅有血管內皮的損傷，還有肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）的升高，且三者存在一定相關性。2010年，Ackland 等［9］通過對大鼠的實驗發現β受體阻斷劑能抑制膿毒癥過程中的全身炎性反應，并保護心臟，改善預后。我國學者也發現，美托洛爾可通過減輕炎癥反應和抑制細胞因子生成來發揮抗細胞凋亡的作用［10］。艾司洛爾是一種高選擇性β1受體阻斷劑，其半衰期短，不良反應小逐漸引起人們的關注［11］。有報道稱艾司洛爾在心肺復蘇過程中有保護心臟，預防室顫的作用［12］。本研究發現，膿毒癥發生過程中，心肌損傷特異性標志物cTnI升高明顯，提示膿毒癥狀態下心肌損傷嚴重。而且，本研究中光鏡下觀察病理結果也證實了心肌細胞大量壞死。治療組結果則表現出應用艾司洛爾可以抑制膿毒癥對心肌的損傷。以往的觀點認為，β1 受體阻斷劑對心肌收縮力及血壓存在負性作用，本研究發現在應用艾司洛爾后大鼠的心率明顯減慢，但心功能的損害反而得到改善，這也從另一方面說明膿毒癥在很大程度上通過增加心率來代償心輸出量的減少。除減慢心率外，艾司洛爾可還能與其抑制腎上腺素能系統，減輕炎性反應，抑制心肌凋亡有關。因此，膿毒癥患者應用短效β受體阻斷劑可以改善心功能，而進一步獲得相對穩定的血流動力學［13］。

心肌細胞凋亡是由多種基因調控的主動死亡過程，一般認為與Bcl-2家族基因、Fas／FasL 基因和caspase家族基因等有關［14］。本研究中大鼠在膿毒癥后3hcaspase-3大量表達，并于12h達到峰值，艾司洛爾干預后caspase-3表達下降，峰值提前。caspase-3被認為在心肌細胞凋亡的級聯反應中占據核心地位，它的大量表達可以激活限制性內切酶將DNA 水解和片段化［15］。β受體阻斷劑可以明顯抑制細胞內質網的應激狀態，而caspase-3是內質網應激反應所具有的特異指標。本研究發現，caspase-3活性增強與cTnI和心肌細胞凋亡指數變化趨勢一致，提示艾司洛爾可能通過抑制caspase-3的活性從而降低心肌細胞凋亡的發生。

綜上所述，早期使用艾司洛爾可以抑制膿毒癥過程中的心肌細胞凋亡，減輕膿毒癥帶來的心功能損害，并獲得相對穩定的血流動力學。但本研究存在觀察例數少、干預時間短等不足，艾司洛爾在膿毒癥患者中的應用有待進一步深入地研究。

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