DRE2基因參與酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控機制的初步研究＊

趙 煒，牛宇杰，袁 源，劉新光，2△

（1.廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所／廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室，廣東東莞523808；2.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東湛江524023）

DRE2從酵母到人類都很保守，它的蛋白結(jié)構(gòu)中含有鐵硫簇，因此被劃分為鐵硫蛋白［1］。鐵硫蛋白具有廣泛的生理功能，例如參與電子呼吸鏈中的電子傳遞，催化三羧酸循環(huán)，參與DNA 修復(fù)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等［2］。DRE2是細胞質(zhì)鐵硫簇組裝機器（cytosolic iron-sulfur cluster assembly，CIA）復(fù)合體的成員之一。酵母DRE2 人類的同源蛋白是CIAPIN1（cytokine-induced apoptosis inhibitor 1），具有抗凋亡的作用，研究發(fā)現(xiàn)在一些對抗腫瘤藥物具有抗性的細胞系中CIAPIN1呈現(xiàn)高表達狀態(tài)［3］。

酵母DRE2主要位于細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)膜上，DRE2基因缺失酵母菌株表現(xiàn)出致死的表型，在氧化應(yīng)激條件下，DRE2和TAH18可以形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，共同參與維持線粒體的完整性和生存［4-5］。本文利用二倍體酵母作為研究對象，構(gòu)建DRE2基因雜合缺失酵母菌株，發(fā)現(xiàn)DRE2基因雜合缺失酵母菌株對抗腫瘤藥物衣霉素表現(xiàn)出抗藥性，并且初步研究了其分子機制。為全面研究DRE2基因功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 野生型二倍體酵母菌株BY4743、載體pRS306由美國華盛頓大學(xué)Matt Kaeberlein博士贈送。La tap酶（貨號RR02MA）購自Takara公司；引物合成、測序由英駿生物科技有限公司完成；其他常規(guī)試劑為本實驗保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 DRE2-URA-F：5′-ACA TTT GAT CTA AGC ATA TAC ACT GTA AGT GAA GGT ATC GAG ATT GTA CTG AGA GTG CA-3′；DRE2-URA-R：5′-AGA CCA ATT GAC GTC ATT TAC TGA AAC GAA TGT GCA GGG TCT GTG CGG TAT TTC ACA CCG-3′；DRE2-F：5′-TCT CGG GGG TAT GAT GGA CT-3′；DRE2-F：5′-ACA TCA AAA GGC CTC TAG GTT CC-3′。

1.2.2DRE2基因破壞元件的擴增以質(zhì)粒pRS306作為PCR模板，DRE2-URA-F、DRE2-URA-R為引物，擴增含有URA3開放閱讀框的破壞元件，全長為1 232bp。Taq酶采用的是La tap，反應(yīng)體系按照試劑說明書進行，PCR 反應(yīng)條件為94 ℃1min；94 ℃30s，58 ℃30s，72 ℃1min，33個循環(huán)；72℃5min。

1.2.3DRE2基因缺失酵母菌株的構(gòu)建 將DRE2基因破壞元件轉(zhuǎn)化進野生型酵母BY4743，通過基因重組原理替換掉野生型酵母基因組上的DRE2基因［6］。利用URA 缺陷型培養(yǎng)板篩選陽性克隆。酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化方法參考分子克隆進行［7］。陽性克隆在液體URA 缺陷型培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取基因組后通過PCR 鑒定，鑒定引物為DRE2-F、DRE2-R，Taq酶采用的是La tap，PCR 反應(yīng)條件為94 ℃，1min；94 ℃，30s，58 ℃，30s，72 ℃，2min，35個 循 環(huán)；72 ℃，5min。

1.2.4DRE2基因缺失酵母菌株的克隆形成實驗 取等量吸光度（A）值處于對數(shù)生長期的野生型菌株和DRE2基因缺失酵母菌株，用無菌水倍比稀釋之后，分別取5μL 滴在YPD 固體培養(yǎng)板和含2μmol／L衣霉素的YPD 固體培養(yǎng)板上，然后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至克隆形成，實驗結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.3DRE2基因缺失酵母菌株復(fù)制壽命的檢測 酵母復(fù)制壽命的檢測分析方法按照文獻［8-9］的方法進行，在顯微鏡下分離、統(tǒng)計酵母母細胞產(chǎn)生子細胞的個數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，酵母復(fù)制壽命結(jié)果以平均數(shù)表示，采用Wilcoxon秩和檢驗方法進行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DRE2基因破壞元件的擴增結(jié)果DRE2基因破壞元件全長為1 232bp，PCR 擴增產(chǎn)物大小經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳確認正確，見圖1。

2.2DRE2基因缺失酵母菌株的鑒定DRE2基因被URA3替換之后，利用位于DRE2基因編碼區(qū)外側(cè)的1條鑒定引物和位于URA3 內(nèi)部的1 條引物可以將野生型菌株（因為無URA3替換原件，所以無擴增片段）和DRE2基因缺失酵母菌株（1 428bp）區(qū)分，見圖2。

圖1 DRE2基因破壞元件的擴增結(jié)果

2.3DRE2基因缺失菌株對衣霉素抗性的檢測 衣霉素是一種經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，本研究發(fā)現(xiàn)DRE2 基因雜合缺失酵母菌株在添加了2μmol／L 衣霉素的YPD 固體培養(yǎng)基上的克隆形成能力顯著高于野生型酵母菌株（實驗結(jié)果重復(fù)3次），見圖3。

2.4DRE2基因缺失菌株復(fù)制壽命的測定 本研究同時檢測了野生型酵母菌株和DRE2基因雜合缺失酵母菌株的復(fù)制壽命（圖4），結(jié)果顯示：兩者平均壽命分別是34、29代，DRE2基因雜合缺失酵母菌株的復(fù)制壽命相對野生型菌株縮短了14.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 PCR 鑒定DRE2基因缺失酵母菌株

圖3 酵母菌株對衣霉素抗性的檢測

圖4 酵母菌株復(fù)制壽命的檢測

3 討 論

釀酒酵母是簡單的單細胞生物，遺傳背景清晰，易培養(yǎng)、生活周期短，因此成為研究基因功能的重要模式生物，被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、衰老等研究領(lǐng)域［10］。

衣霉素是一種天然的核苷抗菌藥物，可以阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)糖基化修飾，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)蓄積，最終導(dǎo)致細胞的壞死或者凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，會激發(fā)細胞保護性的應(yīng)答反應(yīng)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），也稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能降低細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成水平，促進蛋白質(zhì)的正確折疊，或者使錯誤折疊的蛋白降解，起到保護細胞的作用。但過度的應(yīng)激反應(yīng)會激活相應(yīng)的凋亡調(diào)節(jié)因子［11-12］。衣霉素作為經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，在許多實驗中已經(jīng)被證實可以與多種抗腫瘤藥物聯(lián)合運用，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，但是具體的分子機制還不甚明了［13-14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，DRE2基因雜合缺失酵母的菌落形成能力明顯大于野生型，表明DRE2 基因雜合缺失酵母對衣霉素的抗性明顯高于野生型菌株，暗示DRE2很可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)，可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起負調(diào)控作用。

研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)會隨著細胞衰老而發(fā)生一些改變，導(dǎo)致或者加劇細胞衰老的進程［15］。為了進一步研究DRE2基因雜合缺失酵母在含有衣霉素的固體培養(yǎng)基上的菌落形成能力大于野生型是否與其復(fù)制壽命（指一個酵母細胞在死亡之前所能分裂增殖的次數(shù)，即產(chǎn)生子細胞的個數(shù)）有關(guān)，本研究檢測了兩者的復(fù)制壽命，結(jié)果顯示：DRE2基因缺失酵母菌株的復(fù)制壽命明顯低于野生型菌株，表明DRE2 基因雜合缺失酵母對衣霉素的抗性增加不依賴于其復(fù)制壽命。

綜上所述，DRE2基因可能作為酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的負調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白反應(yīng)，同時參與酵母的復(fù)制壽命的調(diào)控。這對于進一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制，揭示衣霉素的抗腫瘤作用機制提供了有益借鑒。

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